Окрашивания сложные: Сложное окрашивание волос: 13 идей с фотографиями

Сложные окрашивания волос❤ в Иркутске

Сложные техники окрашивания – сегодняшний тренд! Сегодня это модно и интересно всем!

Это элегантно, стильно,- такое окрашивание выглядит потрясающе дорого и роскошно! Это то, что придаст Вашему образу современность , подчеркнет вашу красоту и неповторимый стиль!

Сегодня каждая девушка хочет попробовать на себе  уникальные и модные окрашивания:

омбре, шатуш, бейбилайтс, балаяж, американский блонд, рельефное окрашивание, Airtouch, Handtoch! Данные техники  и тренды пришли к нам из США  и очень быстро завоевали популярность у  большинства российских женщин! Сегодня – это мечта! Эти окрашивания будут в тренде еще очень продолжительное время, они только набирают свои обороты!

Что же представляют собой сложные техники окрашивания и чем они отличаются друг от друга?

Омбре – вид окрашивания с плавным переходом от темных корней (зачастую от натурального оттенка)  к светлым концам. Специалисты салона красоты «Элеганс» рекомендуют  различия между корнями и концами волос не более 3-4 тона. В противном случае вы получите обычные отросшие светлые кончики, а не мягкий и плавный  переход.

Деграде – один из разновидностей омбре. Отличие лишь в том, что этот вид окрашивания более сложен в исполнении. Переход должен быть практически незаметен. Разница между корнями и кончиками составляет 1-2 тона. Неискушенный взгляд в плане парикмахерского искусства может увидеть деграде лишь тогда, когда поднесет кончики к корням.

Балаяж – этот эффект создается короткими, и художественными мазками широкой кисти. Фольга при этом методе не используется, в отличие от остальных. Краска наносится от корней к кончикам. Этот вид окрашивания особенно удачно смотрится на коротких волосах – он выглядит максимально натурально. Также этот эффект называют «Поцелуй солнца».

Шатуш – самое сложное и дорогостоящее окрашивание. Основное отличие  в том, что каждая прядь волос окрашивается в свой оттенок, при этом оттенки не могут отличаться  друг от друга более чем на 1-2 тона. Окрашивание производится от кончиков к корням. По завершению процесса окрашивания Вы получите  мягкое осветление, наиболее близкое к вашему природному цвету волос.

«Американский блонд» — это  супер-кропотливая работа мастера. Каждая прядь окрашивается по волоску, осветление очень щадящее, при помощи масел или пасты. На голове при данном окрашивании оказывается от 250 до 400 прядок с фольгой! Это сложнейшая техника набора прядей совершенно по всей голове. В результате окрашивания Вы получаете максимально светлые волосы, а переходы незаметные и плавные! Техника «Американский блонд» выполняется от 4 до 8 часов, но в результате – идеальный цвет и идеальные волосы! С таким окрашиванием можно смело ходить от 6 до 8 месяцев, только раз в 2-3 месяца тонировать волосы, чтобы избавиться от желтизны!

Бейбилайтс – окрашивание волос с эффектом «поцелуя солнца», так нежно называется техника окрашивания. Подходит любому типу лица и помогает создать романтичный образ. После окрашивания Вы получите равномерный цвет, производящий впечатление натурального, естественного с мягким и плавным переходом. Эффект от данного окрашивания настолько тонкий, деликатный, что его можно использовать  для осветления темных волос. Идеальный вариант для тех, кто хочет стать светлее, но не хочет полностью окрашивать свои волосы.

СТОИМОСТЬ СЛОЖНЫХ ОКРАШИВАНИЙ  — ОТ 10.000 руб до 15000 руб! 

Индивидуальная стоимость определяется только после  бесплатной консультации со стилистом салона! 

ВРЕМЯ ВЫПОЛНЕНИЯ СЛОЖНОГО ОКРАШИВАНИЯ ОТ 5 ЧАСОВ ДО 8 ЧАСОВ!

ДЛЯ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ЗАПИСИ НА СЛОЖНОЕ ОКРАШИВАНИЕ  — ОБЯЗАТЕЛЬНА БЕСПЛАТНАЯ КОНСУЛЬТАЦИЯ, НА НЕЙ МЫ ЗАДАДИМ ВАМ КАК МИНИМУМ 10 ВОПРОСОВ О ИСТОРИИ ВАШИХ ВОЛОС, ОПРЕДЕЛИМ СТОИМОСТЬ ОКРАШИВАНИЯ И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ОКРАШИВАНИЯ, УЧТЕМ ВСЕ ВАШИ ПОЖЕЛАНИЯ!

Наши работы

Специалисты

Сложные техники в окрашивании волос 2019, эйртач, омбре, балаяж, Olaplex

Какие они, модные стрижки 2019? И какое самое модное окрашивание волос в 2019 году? Попробуем немного сориентировать вас в данной теме, а за подробностями вы всегда сможете обратиться к опытным специалистам из салона красоты в Геленджике «Art&Crafts» – единственному месту, в котором вам предложат все известные варианты окрашивания.

Сегодня мы говорим категорическое «нет!» однообразию в окрашивании волос. Всем уже приелись плоское одноцветное блондирование и примитивное мелирование, поэтому специалисты постарались изобрести совершенно невероятные способы окрашивания волос, придающие прическам новое звучание.

Всевозможные смешивания цветов, работа с прядями разного объема, контрастный и плавный переход цвета, авторские техники, омбре и шатуш – вот лишь неполный список наиболее популярных запросов клиентов в сегменте наиболее модных видов окрашивания в 2019 году

«Art&Crafts»: эксклюзивные виды окрашивания волос

Наш салон красоты способен предложить вам такие варианты окрашивания, о которых вы еще никогда не слышали. Наши специалисты используют передовые инновационные технологии, работая с эксклюзивными высококачественными материалами. Этому легко найти подтверждение, ведь салон красоты «Art&Crafts» в Геленджике набирает обороты и становится все популярнее с каждым днем, а мы предоставляем высокий сервис и качественный результат с минимальными финансовыми затратами с вашей стороны. Кроме того, многие техники окрашивания волос уникальны, и в других парикмахерских города вы вряд ли найдете мастера, способного осуществить полноценное 3D окрашивание в соответствии со всеми нормами и учетом определенных нюансов или других новейших техник.

У нас вы получите максимальный выбор услуг по покраске волос, которые только известны в мире, и ниже вы сможете прочитать короткое описание популярных техник, а дополнительную информацию о них получить непосредственно у своего мастера.

Разновидности окрашивания волос в «Art&Crafts»

3D окрашивание – уникальная работа специалиста по подбору трех цветов из одной цветовой палитры – теплого, нейтрального и холодного. Техника является одной из наиболее сложных, поэтому выполнять ее могут лишь мастера с хорошим багажом знаний и практической деятельности.

Калифорнийское мелирование – подбор супермодного цвета с эффектом выгорания благодаря соединению золотистых, песочных и карамельных тонов. Плавные переходы цветов и максимальная натуральность – главные фавориты этой техники;

Мелирование вот уже многие годы не выходит из моды, а лишь видоизменяется и совершенствуется. Сегодня к вашим услугам предлагается:

• Американское мелирование – сочетание трех и более оттенков на прядях разного объема. Для видимого контраста часто применяют яркие цвета – коньяк, вишня, баклажан;

• прикорневое мелирование темных и светлых волос – прекрасный способ придать прическе объем.

Омбре вот уже несколько лет возглавляет хит-парад актуальных видов покраски волос. Это плавный или резкий переход от темного цвета к светлому – смотрится ярко и нетривиально. Разновидностью омбре волос является смоки-блонд с явным акцентом на корнях.

Балаяж – подбор палитры из нескольких оттенков в индивидуальном порядке. Контрастность соблюдается в виде четких границ, что смотрится очень стильно и на коротких стрижках, и на волосах средней длины.Шатуш – это чередование светлых и темных оттенков, выбранных без определенной системы, хаотично, границы которых растушевываются для придания эффекта выгоревших прядей.

Эир тач – пряди волос выбираются по определенной схеме и обдуваются феном перед покраской, чтобы получить максимально природный вариант осветления волос без явных переходов.

Что вы слышали о брондировании? Или вам кажется, что это слово написано с ошибкой? Вовсе нет, это новомодная техника покраски в виде плавного перехода от темных оттенков к светлым, причем более темным выступает фоновый цвет, а для прядей выбирают мягкие медовые, янтарные и перламутровые тона.

Блонетирование – применение золотисто-бежевых цветов на светлых волосах, когда оттенок меняется от насыщенного до очень нежного.

Не можете выбрать, кем хотите стать – блондинкой или брюнеткой? Тогда мы предложим вам зональное колорирование в виде горизонтального или вертикального разделения волос на несколько равных зон, для которых выбирается желаемый тон.

Блочное окрашивание волос – идеальный вариант придать яркость ассиметричной прическе с подбритыми висками или выбритыми затылками, а сегментное – прическам на коротких волосах.

Вы знакомы с понятием «контуринг», которое впервые применила знаменитая Ким Кардашьян? Он позволяет внести коррективы не только в прическу, но и во внешность. Интересно, как именно? Приходите, мы сделаем это вместе!

Если вы хотите получить яркий перламутровый оттенок, предлагаем протестировать жемчужное окрашивание, которое подразумевает смешивание различных оттенков с последующим нанесением их на базу с платиновым подтоном – невероятно нежно и натурально.

Вот далеко не все варианты, с помощью которых мы изменим вас внешне. Вас ждет еще много интересного, если вы позвоните и запишитесь в салон «Art&Crafts» в Геленджике. Главное – настроиться на то, что ваша жизнь уже не будет прежней, она кардинально изменится в лучшую сторону!

Ниже перейдя по ссылке вы можете выбрать краситель, который хотите использовать в

ПО ЛЮБОМУ ВОПРОСУ ВАС МОГУТ ПРОКОНСУЛЬТИРОВАТЬ

ПО ТЕЛЕФОНУ

+7(900)258-07-50

Восстановление волос, сложные окрашивания(балаяж в Рязани | Услуги

По поводу отрицательного отзыва.

За полтора года работая на этом составе, я слышала только восторг моих клиентов от ботокса. Это первый негативный отзыв.

😤Я предупредила, что эффект от процедуры накопительный и я не фея, что бы из запущенных сухих волос за один раз волосы превратятся в шикарную шевелюру.

😤Ботокс это не кератин, он не выпрямляет волосы, он убирает лёгкую пушистось и питает волос. Волосы падают, это проблема изнутри организма, нехватка витаминов, тем более девушка кормит грудью и соответсвенно волосы не айс в этот период.

😤Так же домашний уход это 70% ухоженности волос который зависит от Вас.
Я НЕ ОПРАВДЫВАЮ СЕБЯ, НО И ПОЛИВАТЬ МЕНЯ ГРЯЗЬЮ И ЗА НИЗКИЙ РЕЙТИНГ НЕ ПОЗВОЛЮ.

💐Доброго времени суток дорогой друг!
😊Давай знакомиться моё имя Ольга
✂Работаю в парикмахерском деле со стажем 19 лет
🌞Более 7000 клиентов преобразились в моих руках , возвращались с новыми пожеланиями
💖Мастер любимого дела : инвестирую в знания,учёбу,материалы
💯Никакой экономии на красителе выбираю бренд в работе
♻Бесплатно проконсультирую по уходу за волосами
🎯Если Ваша цель найти мастера к которому захочется вернуться вновь и вновь
🏠Жду в салоне BEAYTU CAFE 62 по адресу ул. Соборная 46
Предоставляю виды
парикмахерских услуг:
☘ стрижки
☘ окрашивание
☘карвинг
☘ботокс для волос
☘нанопластика
☘ кератиновое выпрямление
☘ботопластика ❗новинка
☘экспресс уходы
☘укладки
☘полировка волос
☘локоны и др.салонные процедуры.
Использую профессиональную краску
🌷MATRIX
🌷BLOND ME
🌿мелирование (американское, калифорнийское, поперечное, диагональное)
🌿окрашивание (омбре, балаяж, шатуш, деграде, брондирование)
🌿Смывка цвета (декапирование). 🌿Блонд (пепельный, натуральный, карамельный, золотистый, бежевый, светло кофейный) 
🌿Выведение из брюнетки в блонд
🌿Избавление от желтизны.
🌿Цветное колорирование
🌿Блики.
🌿100%закрашивание седины.

-НАНОПЛАСТИКА(Кератин нового поколения.Восстанавливает поврежденную структуру волос.Надолго(до 4-5 месяцев) делает волосы прямыми гладкими и блестящими). 

-БОТОКС для волос (Это тотальное восстановление,без функции выпрямления.Полностью восстанавливает даже самые поврежденные локоны,убирает пористость,пушистость.Делает структуру волоса однородной и блестящей.
Мягкие шелковистые волосы с бриллиантовым блеском.Пушистость и ломкость устраняется.

А так же уход и вкусняшки для Ваших волос🤗

омбре, airtouch, шатуш — Статьи — Стилист колорист парикмахер Светлана Парфенова в Новогорске Эдем Куркино Химки

Представьте свои волосы в переливающейся палитре оттенков: светлый плавно переходит в русый, платиновый в шатен… Знаете ли вы, что при сложном окрашивании любая стрижка выглядит свежей и более привлекательной, а волосы гораздо больше густыми, чем есть на самом деле? Это не волшебство, а поистине ювелирная работа мастера, который долго обучается таким техникам. И вполне логично, что исполнить их дома без наличия арсенала инструментов и тем более знания правил — невозможно.

Итак, давайте ближе познакомимся с вариантами сложного окрашивания. Все они делаются с отступлением от корневой части волос, подразумевают плавный переход оттенков и могут использоваться почти для любой стрижки, длины, густоты. А вот несколько плюсов шатуш, омбре, airtouch и некоторых других техник:

— ваши волосы сохраняют здоровье, так как краска наносится в основном на отросшую часть волос;

— вы сможете как минимум несколько месяцев не посещать стилиста, так как отрастание волос происходит естественно;

— ваш вид будет всегда «на миллион», даже если вы соберете волосы в обычный пучок или конский хвост.

Самое главное преимущество — ваши волосы обретут новый свежий и главное модный стиль, ведь любая техника сложного окрашивания относится к тренду 2018 года!

Из минусов можно отметить использование дорогостоящих инструментов, красок и средств по уходу, а также длительность процедуры из-за ее невероятной сложности. Поэтому любое из упомянутых окрашиваний не может стоить мало. Если вам предлагают низкую цену — откажитесь! В этом случае 100% результат будет не тот, который ожидается!

В чем разница?

Классическое омбре подразумевает плавный переход от более темных корней к светлым кончикам. Существуют вариации такого окрашивания, такие как брондирование, черепаховое, карамельное, многоцветное омбре и обрамление стрижки контрастным оттенком. Поверьте, и это еще не все. Хороший стилист подскажет вам наиболее правильный вариант для вашего случая.

Шатуш происходит от слова «shahtoosh», означающего редчайшую разновидность шерсти класса люкс. Это эффект выгоревших под мягким южным солнцем волос. Делается в основном на длинные и средние волосы, исполняется только на воздухе и подразумевает размытый переход между оттенками. Каждый локон осветляется с натуральным эффектом, который может подчеркнуть ваши достоинства.

Вероятно, вы уже догадались что «airtouch» переводится как «касание воздуха». Суть процесса окрашивания заключается в использовании холодного потока воздуха с помощью фена. Таким образом стилист отделяет тонкие и ослабленные волоски и окрашивает те, которые остались. Такой вариант смотрится великолепно на любых волосах, да и оттенки можно выбирать самые разные.

Для улучшения эффекта до или после окрашивания можно использовать еще и технологию флисинга. Она заключается в нанесении состава на прикорневую зону головы с целью заметного увеличения объема. В сочетании со сложным окрашиванием эффект получается потрясающим!

Ошибок в создании индивидуального образа быть не может априори. Любое попадание краски не на ту прядь приведет к пятнам и резким переходам от одного оттенка на другой. А флисинг в исполнении не профессионала может привести и вовсе к непредсказуемому эффекту начеса. Чтобы в результате не выглядеть смешно, доверяйте свои волосы хорошему стилисту. И тогда на несколько месяцев сможете забыть о посещении салона красоты, а на укладку будете тратить минимальное количество времени.

А какой тип окрашивания вам более по душе? Поделитесь в комментариях или задайте вопросы стилисту.

что это такое? Тренды 2021 – виды техники, как делают покраску длинных волос, средней длины и стрижек. Варианты окрашивания для блондинок, русых и темных волос.

Всем иногда хочется перемен. Проще всего начать с внешности — например, сменить цвет волос. Не стоит, однако, рубить с плеча, надолго обрекая себя на красные или синие пряди. Присмотритесь к техникам сложного окрашивания. Они подарят максимально естественный результат и абсолютно новый образ

© pexels.com/murat esibatir

Что такое сложное окрашивание волос?

Сложное окрашивание волос — это техника, которая подразумевает использование нескольких оттенков краски. При этом мастера могут сочетать различные приемы, например мелирование и колорирование. Цвета, как правило, плавно растягиваются, граница между оттенками практически незаметна.
Такие виды окрашивания требуют от мастера конкретных навыков и высокого уровня мастерства.

Преимущества сложного окрашивания волос

Сейчас сложные техники практически вытеснили полное окрашивание. С чем же связана такая популярность? Перечислим основные преимущества.

• Натуральность и естественность, которые достигаются за счет гармоничной игры цветов.

• Сложные техники окрашивания подходят для волос любого исходного оттенка.

• Большая вариативность сочетаний цветов.

• Результат не требует частого обновления, поскольку у окрашивания нет четких границ.

• Сложное окрашивание способно не только подчеркнуть достоинства внешности, но и замаскировать некоторые недостатки.

Минусы сложного окрашивания

Даже на солнце есть пятна, поэтому при всех достоинствах сложного окрашивания надо отметить, что и у него есть отрицательные стороны.

• Техника требует большого терпения в исполнении и очень затратна по времени. На длинных волосах процедура окрашивания может занять до 8 часов.

• Такое окрашивание сложно выполнить самостоятельно.

Кому подойдет?

Сложное окрашивание всегда дает гармоничный результат, если все сделать правильно. Важно грамотно подобрать краски — так, чтобы новые оттенки подходили вам по цветотипу.
Некоторые виды сложного окрашивания невыполнимы на очень коротких волосах. Но есть актуальные техники, которые отлично сработают и на небольшой длине.

Отметим также, что мы не рекомендуем красить поврежденные и ослабленные волосы. Для таких локонов окрашивание будет дополнительным стрессом. Лучше вернуться к этим планам, когда волосы пройдут курс реабилитации и полностью восстановятся.

Вернуться к оглавлению

Какие техники окрашивания волос относятся к сложным?

Чтобы вы получили более ясное понимание о том, что же такое сложное окрашивание, расскажем, какие техники входят в эту категорию.

Балаяж

Балаяж — это яркие светлые штрихи, которые эффектно переливаются на локонах. Такие блики выглядят одновременно естественно и романтично-кокетливо. В этой технике, как правило, играют с «температурой» оттенков: золотистые и кремовые прядки будут гармонировать с каштановыми волосами, а холодные тона добавят сдержанного благородства русым волосам.

Сложное мелирование

В сложном мелировании окрашивается довольно большой процент прядей, при этом используют сразу несколько оттенков. Этот вид окрашивания чрезвычайно эффективен в деле маскировки седины.

Шатуш

Переход от темных корней к светлым кончикам по-прежнему актуален. Шатуш добавляет прическе визуального объема и дает возможность примерить новый цвет без полного окрашивания волос.

Air Touch

Полюбившаяся многим техника, при которой из удерживаемой в руке пряди часть волос выдувается феном, а оставшаяся окрашивается в светлые оттенки. Результат выглядит очень нежно и максимально натурально.

Вернуться к оглавлению

Сложное окрашивание для брюнеток

Брюнеткам можем посоветовать балаяж в теплой гамме. Этот вид сложного окрашивания точно стоит попробовать девушкам с каштановым цветом волос. Шатенки также могут положиться на балаяж: светлые пряди правильно подобранных оттенков не будут спорить с основным цветом волос.

Очень темные брюнетки будут в выигрыше, если сделают сложное калифорнийское мелирование — для смягчения восприятия базового цвета волос.

Для дерзких и уверенных в себе красоток есть более смелый вариант — зональное окрашивание, когда в контрастные оттенки красят челку или пряди, обрамляющие лицо.

Вернуться к оглавлению

Варианты сложного окрашивания для блондинок

Блондинкам очень идет колорирование: сочетание нескольких цветов на светлой базе выглядит очень эффектно.

Если у светлых волос теплый подтон, то окрашивание шатуш с использованием красок холодных оттенков может дать неожиданный и интересный результат, подарив волосам аристократичное прохладное сияние.

Вернуться к оглавлению

Сложное окрашивание для русых

Русый цвет волос можно сравнить с чистым холстом: он позволяет экспериментировать практически с любыми оттенками.
Шатуш, балаяж, сложное мелирование — все эти техники одинаково хороши для «декорирования» русых локонов. Важно только не прогадать с цветом. Примерить на себя приглянувшиеся оттенки теперь удобно при помощи онлайн-сервисов.

Вернуться к оглавлению

Сложное окрашивание для рыжеволосых

На волосах огненного спектра сложное окрашивание дает просто магнетический эффект.

И без того редкий цвет волос можно сделать уникальным, прибегнув к карамельному или медному мелированию. От рыжей шевелюры с такими акцентами просто глаз не отвести.
Шатуш или омбре на огненных локонах лучше всего делать в оттенках золотистого блонда.

Вернуться к оглавлению

Тренды 2021 года: фотоидеи для сложного окрашивания волос

Выбирая технику сложного окрашивания, нужно обязательно учитывать длину волос. Рассмотрим конкретные примеры на фото.

Короткие волосы

Скажем прямо, короткие стрижки — не самая благодатная почва для получения игры цвета за счет плавных переходов между оттенками, то есть для того, на что нацелено сложное окрашивание. Выходом может стать зональное окрашивание или акцентное мелирование. Такие техники дают красивый результат на асимметричных стрижках.

Длинные волосы

Красота переходов и плавной растяжки цвета максимально раскрывается именно на длинных волосах.

Для работы в техниках балаяж и шатуш подойдут любые вариации красок в палитре блонд. Главное, чтобы они гармонировали между собой и органично сочетались с базовым цветом волос.

Волосы средней длины

Наиболее удачно на средние волосы ляжет частое мелирование. Окрашивание в технике омбре тоже обещает вдохновляющий результат. Средняя длина также позволяет экспериментировать и с такой техникой, как air touch.

Вернуться к оглавлению

3 краски для качественного окрашивания

Представляем нашу подборку красок для выполнения сложного окрашивания.

Краски Garnier Color Sensation и Color Naturals

Варианты ультрапепельного и холодного блонда найдутся в линейке Garnier Color Sensation. Краски № 101 «Платиновый блонд» и № 911 «Дымчатый ультраблонд» отлично подойдут для работы в технике сложного окрашивания, например air touch.

Волосы приобретут нежные пшеничные нотки с красками из серии Garnier Color Naturals. Краска № 1002 «Жемчужный ультраблонд» не только подарит волосам красивый цвет — она включает бальзам-уход, который будет способствовать восстановлению структуры локонов.

Чувственные пряди медных оттенков вы получите с краской Garnier Color Sensation № 6.45 «Янтарный темно-рыжий».

Краски L’Oréal Paris Préférence Cool Blondes

Палитра Préférence Cool Blondes порадует тех, кто мечтает о морозном сиянии на волосах.

Оттенки № 8.12 «Аляска» и № 9.12 «Сибирь» подарят волосам насыщенные и чистые оттенки блонда. Благодаря специальной формуле защиты цвета результат долгое время сохраняет первоначальную яркость. В случае проявления нежелательной желтизны поможет маска с фиолетовыми пигментами.

Краски L’Oréal Paris Colorista

Со стойкой краской из линейки L’Oréal Paris Colorista можно сделать стильное розовое мелирование или даже дерзкое красное омбре.
Краска с гелевой текстурой отлично подойдет для домашнего окрашивания — не будет стекать, пачкая одежду.

Если к стойкому цветному окрашиванию вы пока не готовы, рекомендуем присмотреться к коллекции временных красителей Colorista. В ней представлены средства самых разных форматов: и спреи, и бальзамы, и красящие желе.

Вернуться к оглавлению

Уход за волосами после сложного окрашивания

После сложного окрашивания волосам необходим особый уход. Специальные продукты для окрашенных волос продлят стойкость цвета и помогут волосам восстановиться после осветления. Расскажем, какими средствами имеет смысл пополнить домашний бьюти-арсенал.

Garnier Fructis «Годжи. Стойкий Цвет»

Шампунь и бальзам этой серии не только защищают цвет и придают блеск, но и укрепляют волосы, делая их со временем визуально более густыми. Формула с витаминами и экстрактами фруктов питает локоны и создает на волосах защитное покрытие, которое препятствует вымыванию цвета.

Фиолетовые шампунь и маска L’Oréal Paris Elseve «Эксперт Цвета»

Горячая укладка, жесткая водопроводная вода и прочие внешние факторы влияют на осветленные волосы не лучшим образом, и со временем на них может появиться желтизна.
«Очистить» цвет и нейтрализовать простоватую желтизну помогут фиолетовые шампунь и маска «Эксперт Цвета» Elseve от L’Oréal Paris. Если использовать их раз в неделю вместо обычного ухода, то неприятная желтизна останется лишь воспоминанием.

Масло-эликсир «Преображение» от Garnier Fructis

Сложное окрашивание почти всегда подразумевает осветление или обесцвечивание. Эти процедуры могут привести к сухости волос и секущимся кончикам. Специальное масло не требует смывания, питает волосы и придает им ухоженный и здоровый вид.

Вернуться к оглавлению

Сложное окрашивание: что советуют стилисты?

Что важно учесть при сложном окрашивании седых волос, например при мелировании?

Как часто нужно повторять/обновлять сложное окрашивание волос?

Основной плюс всех видов сложного окрашивания в том и заключается, что волосы отрастают без ущерба эстетике и граница между окрашенными и неокрашенными волосами воспринимается размытой. Но для поддержания красивого оттенка можно раз в несколько месяцев делать тонирование.

Обязательно ли после сложного окрашивания волос в светлые оттенки делать тонирование для поддержания качества цвета или достаточно использовать специальные средства для ухода?

Вернуться к оглавлению

Современные техники окрашивания

ЧЕТЫРЕ самые актуальные салонные техники окрашивания без использования начеса и контуринг у лица — на курсе СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНИКИ ОКРАШИВАНИЯ факультета КОЛОРИСТИКИ школы DEMETRIUS: 

• ОМБРЕ 
• ШАТУШ 
• БАЛАЯЖ 
• ОБЪЕМНОЕ ОКРАШИВАНИЕ 

Это «стандартный набор» необходимых навыков мастера в области окрашивания волос, который должен в совершенстве освоить успешный мастер!

Если вы:

• не уверены в своем профессиональном мастерстве
• хотите следовать модным тенденциям и предлагать клиентам тренды
• чувствуете, что вам не хватает знаний 
• волнуетесь за конечный результат окрашивания и устали искать причины ошибок

На курсе обучения парикмахеров СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНИКИ ОКРАШИВАНИЯ вы научитесь:

• растяжке цвета, уже ставшей классикой и дающей плавный градиент от темных корней к максимально светлым концам
• растяжке цвета, позволяющей добиться эффекта выгоревших прядей на окрашенных или натуральных волосах, и идеально подходящей для коррекции отросшей растяжки или блонда
• создавать эффект цветового контраста между кончиками и основными прядями или же между корнями и остальными волосами
• добиваться максимального рассветления с рельефным рисунком, максимально близко к корню
• разбивать мелирование, добавлять прядей блондинкам и создавать красивый рисунок с нечитаемыми прядями разной толщины
• комбинировать все нюансы

После обучения вы:

• станете экспертом в области современных модных окрашиваний
• сможете гарантированно получать запланированный результат и выполнять работу на высшем классе
• исключите ошибки в процессе окрашивания
• получите модных и изысканных клиентов
• легко поднимите цене на свои услуги

Продолжительность курса: 2 дня.
Для мастеров с опытом от 1,5 года 

Становитесь топовыми мастерами вместе с DEMETRIUS и получайте преданных клиентов!

Обучение самым модным и актуальным женским стрижкам – вы найдете на курсах обучения парикмахеров факультета ЖЕНСКИХ СТРИЖЕК школы DEMETRIUS. 

за что вы платите деньги?

Вместе с тренером-технологом и арт-директором сети экосалонов Сosmico Маргаритой Буйко-Черницкой разбираемся, что такое сложное окрашивание и почему услуги колориста не могут стоить дешево.

— Во-первых, давайте определим в каком случае окрашивание считается сложным. Если речь идет о паре прядях у лица, которые дают эффект выгоревших волос, – это будет считаться обычным окрашиванием. На натуральных, ранее не окрашенных, волосах оно выполняется достаточно просто, в один этап.

Такие сложные виды окрашивания, как шатуш, балаяж, airtouch, являются многоступенчатыми. Например, шатуш — техника нанесения красителя на начес, с помощью которой создается плавный переход от темных корней к светлой длине. Даже на натуральных волосах может занимать от 3 до 8 часов. Поэтому работа хорошего мастера в этом случае будет высоко цениться.

Во-вторых, важно учитывать состояние волос перед окрашиванием. Часто клиент приходит с целой историей предыдущих окрашиваний: отросший корень своего цвета, окрашенная сложной техникой середина, осветленные концы, — и все это на одной голове. Тогда мастер для окрашивания разводит разные составы краски, использует разные техники нанесения, выдерживает краситель на волосах разное количество времени.

Количество прядей, будь то 10, 20 или 30, не сильно влияет на длительность и стоимость процедуры. Определяющим фактором являются этапы и количество используемых средств. Иногда бывает, что одного осветления недостаточно и нужно делать повторное, чтобы поднять фон осветления и добиться того оттенка, который желает клиент. 

Еще важный момент — мы в Cosmico всегда боремся за качество волос. Поэтому нередко частью сложного окрашивания становится процедура восстановления волос. Она может быть сделана не только после, но и до или во время окрашивания. От этого зависит результат и качество ваших волос после окрашивания.

Окрашивание — это не просто техническая работа, — это дизайн. Профессиональный стилист обязательно подберет окрашивание к тону кожи, типу лица, а также выберет правильную технику. Профессионализм и опыт мастера — залог максимально красивого и дорого цвета.

Нужна ли личная консультация перед сложным окрашиванием?

Конечно, нужна! Ее можно провести за несколько дней до окрашивания и она в наших экосалонах всегда бесплатная.

Что важно рассказать мастеру о своих волосах?  

— какие у вас волосы: натуральные, окрашенные или осветленные;

— использовали ли вы хну, либо тонирующие средства дома;

— делали ли кератиновое выпрямление, что тоже влияет на процесс окрашивания волос.

Возможно, вам понадобится сделать тест-прядь. Она покажет, выдержат ли волосы осветление и какой будет результат. Только потом мастер предложит возможные варианты окрашивания, укажет, сколько времени оно займет и назовет стоимость.

Чем рискует клиент который хочет побыстрее и подешевле?

— Качеством волос, предсказуемостью результата окрашивания, стойкостью цвета.

Как недобросовестные парикмахеры достигают более низкой цены?

— Либо сокращают количество красителя, пытаясь растягивать цвет по волосам, что приводит к неравномерному окрашиванию. Либо жертвуют качеством красителя. Дешевые красители негативно отражаются на качестве волос.

Спешка в окрашивании тоже отражается на качестве волос не в лучшую сторону. Каждое средство и каждый краситель имеет определенное время выдержки.

Как же сэкономить на таком окрашивании?

— Если ваше окрашивание выполнил опытный мастер, повторный визит можно отложить на 2-3 месяца. Многие мои клиентки ходят с одной растяжкой по 4-6 месяцев, так как корни отрастают очень плавно и не требуют явной коррекции.

Еще совет: покупайте тонирующие кондиционеры или маски, но только профессиональные! Попросите вашего мастера подобрать вам подходящий оттенок. Хорошее тонирующее средство будет долго поддерживать цвет волос и не помешает при следующем окрашивании в салоне. Дешевые тоники сомнительного качества могут вступить в химическую реакцию с окрашивающим пигментом.

В наших экосалонах Сosmico вам помогут воплотить любые ваши фантазии в жизнь: от сложных окрашиваний с естественными оттенками до последних трендов с использованием ярких цветов и резких переходов. Приходите за консультацией — мастера с удовольствием подберут образ, который подойдет именно вам!

Грамм Окрашивание

Создано Моникой З. Брукнер

Что такое окрашивание по Граму?

Окрашивание по Граму

— это распространенный метод, используемый для дифференциации двух больших групп бактерий на основе их различных компонентов клеточной стенки. Процедура окрашивания по Граму различает грамположительные и грамотрицательные группы путем окрашивания этих клеток в красный или фиолетовый цвет. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет из-за наличия толстого слоя пептидогликана в их клеточных стенках, который сохраняет кристаллический фиолетовый цвет, которым окрашены эти клетки.В качестве альтернативы грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет, что связано с более тонкой стенкой пептидогликана, которая не сохраняет кристаллический фиолетовый во время процесса обесцвечивания.

Как работает окрашивание по Граму?

Окрашивание по Граму включает три процесса: окрашивание водорастворимым красителем, называемым кристаллическим фиолетовым, обесцвечивание и контрастное окрашивание, обычно сафанином. Из-за различий в толщине пептидогликанового слоя в клеточной мембране между грамположительными и грамотрицательными бактериями грамположительные бактерии (с более толстым пептидогликановым слоем) сохраняют окраску кристаллическим фиолетовым во время процесса обесцвечивания, в то время как грамотрицательные бактерии теряют окраску кристаллическим фиолетовым. и вместо этого окрашиваются сафранином в процессе окончательного окрашивания.Процесс состоит из трех этапов:

1. Клетки окрашены кристально-фиолетовым красителем. Затем добавляют раствор йода по Граму (йод и йодид калия) для образования комплекса между кристаллическим фиолетовым и йодом. Этот комплекс представляет собой более крупную молекулу, чем исходный кристаллический фиолетовый краситель и йод, и нерастворим в воде.
2. К образцу добавляется обесцвечивающее средство, такое как этиловый спирт или ацетон, которое обезвоживает слой пептидогликана, сжимая и стягивая его. Большой кристаллический комплекс фиолетово-йода не может проникнуть через этот плотный пептидогликановый слой и, таким образом, задерживается в клетке грамположительными бактериями.Напротив, внешняя мембрана грамотрицательных бактерий разрушается, и более тонкий пептидогликановый слой грамотрицательных клеток неспособен удерживать комплекс кристаллического фиолетового йода, и цвет теряется.
3. К образцу добавляется контрастное краситель, например, слабо растворимый в воде сафранин, окрашивающий его в красный цвет. Поскольку сафранин светлее кристаллического фиолетового, он не нарушает пурпурную окраску грамположительных клеток. Однако обесцвеченные грамотрицательные клетки окрашиваются в красный цвет.

Порядок окрашивания и проблемы:

Реактивы:

• Кристально-фиолетовый (первичная окраска)
• Раствор йода / йод по Граму (протрава, фиксирующая кристаллический фиолетовый цвет на клеточной стенке)
• Обесцвечивающее средство (например, этанол)
• Сафранин (вторичная окраска)
• Вода (желательно в шприц-бутылке)

1. Сделайте слайд с образцом клеток для окрашивания. Закрепите образец на предметном стекле нагреванием, осторожно пропустив предметное стекло с каплей или небольшим кусочком образца через горелку Бунзена три раза.
2. Добавьте основной краситель (кристаллический фиолетовый) к образцу / предметному стеклу и инкубируйте в течение 1 минуты. Промойте предметное стекло слабой струей воды не более 5 секунд, чтобы удалить несвязанный кристаллический фиолетовый цвет.
3. Добавьте йод по Граму на 1 минуту — это протрава или средство, которое фиксирует кристаллический фиолетовый на стенке бактериальной клетки.
4. Промойте образец / предметное стекло ацетоном или спиртом в течение ~ 3 секунд и промойте слабой струей воды . Спирт обесцвечивает образец, если он грамотрицательный, удаляя кристаллический фиолетовый цвет.Однако , если спирт остается в образце слишком долго, он также может обесцвечивать грамположительные клетки .
5. Добавьте вторичный краситель, сафранин, на предметное стекло и инкубируйте в течение 1 минуты. Стирать под слабой струей воды не более 5 секунд. Если бактерия является грамположительной, она сохранит первичную окраску (кристаллический фиолетовый) и не получит вторичную окраску (сафранин), из-за чего под микроскопом она будет выглядеть фиолетовой / пурпурной. Если бактерия является грамотрицательной, она теряет первичную окраску и приобретает вторичную окраску, из-за чего она становится красной при просмотре под микроскопом.

Литература

Ссылки по теме

Преподавательская деятельность

Дифференциальные методы окрашивания — Микробиология: лабораторный опыт

Просмотр бактериальных клеток

Микроскоп — очень важный инструмент в микробиологии, но есть ограничения, когда дело доходит до его использования для наблюдения за клетками в целом и бактериальными клетками в частности.Двумя наиболее важными проблемами являются разрешение и контраст. Разрешение — это ограничение, с которым мы ничего не можем поделать, поскольку большинство бактериальных клеток уже близки к пределу разрешения большинства световых микроскопов. Тем не менее, контраст можно улучшить либо с помощью оптической системы другого типа, такой как фазовый контраст или микроскоп для дифференциального интерференционного контраста, либо путем окрашивания клеток (или фона) хромогенным красителем, который не только добавляет контраст, но и дает им тоже цвет.

В микробиологии используется множество различных красителей и процедур окрашивания. Некоторые включают одно пятно и всего несколько шагов, в то время как другие используют несколько пятен и более сложную процедуру. Прежде чем вы сможете начать процедуру окрашивания, клетки должны быть закреплены (размазаны) и зафиксированы на предметном стекле.

Бактериальный мазок — это просто небольшое количество культуры, растекающееся очень тонкой пленкой на поверхности предметного стекла. Чтобы предотвратить вымывание бактерий во время этапов окрашивания, мазок может быть химически или физически «прикреплен» к поверхности предметного стекла.Тепловая фиксация — это простой и эффективный метод, который достигается путем кратковременного пропускания предметного стекла через пламя горелки Бунзена, в результате чего биологический материал становится более или менее прочно прикрепленным к поверхности стекла.

Термофиксированные мазки готовы к окрашиванию. При простом окрашивании в мазок добавляются красители, которые либо притягиваются зарядом (катионный краситель, такой как метиленовый синий или кристаллический фиолетовый), либо отталкиваются зарядом (анионный краситель, такой как эозин или тушь). Катионные красители связывают бактериальные клетки, что хорошо видно на ярком фоне.Анионные красители отталкиваются клетками, поэтому клетки становятся яркими на окрашенном фоне. Примеры того и другого см. На рисунках 1 и 2.

Рисунок 1. Отрицательное окрашивание Cyptococcus neoformans , инкапсулированных дрожжей.
Рисунок 2. Положительное окрашивание на золотистый стафилококк .

Вероятно, наиболее важной особенностью, которая становится очевидной при окрашивании бактериальных клеток, является их клеточная морфология (не путать с морфологией колоний, которая представляет собой появление бактериальных колоний на чашке с агаром).Большинство гетеротрофных и культивируемых бактерий имеют несколько основных форм: сферические клетки (кокки / кокки), палочковидные клетки (палочки / бациллы) или палочковидные клетки с изгибами или изгибами (вибрионы и спириллы соответственно). Существует большее разнообразие форм среди архей и других бактерий, встречающихся в экосистемах, отличных от человеческого тела.

Часто бактерии создают определенные расположений клеток, которые образуются в результате бинарного деления бактериями во время их размножения. Договоренности особенно очевидны с неподвижными бактериями, потому что клетки имеют тенденцию оставаться вместе после завершения процесса деления.И форма, и расположение клеток являются характеристиками, которые можно использовать для различения бактерий. Наиболее часто встречающиеся формы бактерий (кокки и бациллы) и их возможное расположение показаны на рисунках 3 и 4.

Рисунок 3. Возможное расположение бактериальных клеток для кокков.

Рисунок 4. Возможное расположение бактериальных клеток для бацилл.

Дифференциальные методы окрашивания

В микробиологии методы дифференциального окрашивания используются чаще, чем простые окрашивания, как средство сбора информации о бактериях.Методы дифференциального окрашивания, которые обычно требуют более одного окрашивания и нескольких этапов, называются таковыми, потому что они позволяют дифференцировать типы клеток или клеточные структуры. Самым важным из них является окраска по Граму. Другие методы дифференциального окрашивания включают окрашивание эндоспор (для выявления бактерий, образующих эндоспоры), кислотостойкое окрашивание (для отличия видов Mycobacterium от других бактерий), метахроматическое окрашивание для выявления гранул, накапливающих фосфаты, и окрашивание капсул (для идентификации инкапсулированные бактерии).Мы будем выполнять процедуры окрашивания по Граму и эндоспор в лаборатории и просматривать подготовленные слайды, которые выделяют некоторые другие клеточные структуры, присутствующие в некоторых бактериях.

Пятно по грамму

Рисунок 5. Бактерии, окрашенные по Граму.

В 1884 году врач Ганс Кристиан Грам изучал этиологию (причину) респираторных заболеваний, таких как пневмония. Он разработал процедуру окрашивания, которая позволила ему идентифицировать бактерию в легочной ткани, взятой у умерших пациентов, как этиологический агент фатальной пневмонии.Хотя метод окрашивания по Граму мало помог в лечении болезни, он значительно упростил диагностику причины смерти человека при вскрытии. Сегодня мы используем методы окрашивания по Граму, чтобы помочь в идентификации бактерий, начиная с предварительной классификации на одну из двух групп: грамположительных или грамотрицательных .

Дифференциальная природа окраски по Граму основана на способности некоторых бактериальных клеток сохранять первичное окрашивание (кристаллический фиолетовый), сопротивляясь процессу обесцвечивания.Окрашивание по Граму включает четыре этапа. Сначала клетки окрашивают кристаллическим фиолетовым с последующим добавлением фиксирующего агента для окрашивания (йода). Затем применяется спирт, который выборочно удаляет пятно только с грамотрицательных клеток. Наконец, добавляется вторичный краситель, сафранин, который окрашивает обесцвеченные клетки в розовый цвет.

Хотя в то время Грам не знал этого, основное различие между этими двумя типами бактериальных клеток — это их клеточные стенки. Стенки грамотрицательных клеток имеют внешнюю мембрану (также называемую оболочкой), которая растворяется во время мытья спиртом.Это позволяет красителю кристаллического фиолетового ускользнуть. Только обесцвеченные клетки поглощают розовый краситель сафранин, что объясняет разницу в цвете между двумя типами клеток. По завершении процедуры окрашивания по Граму грамположительные клетки выглядят пурпурными, а грамотрицательные — розовыми.

При интерпретации мазка, окрашенного по Граму, необходимо также описать морфологию (форму) клеток и их расположение. На рисунке 5 представлены два различных типа бактерий, которые можно различить по реакции окрашивания по Граму, а также по их форме и расположению.Ниже опишите эти характеристики для обеих бактерий:

Кислотостойкое пятно

Некоторые бактерии производят восковое вещество миколик кислоту , когда они конструируют свои клеточные стенки.Миколиновая кислота действует как барьер, защищающий клетки от дегидратации, а также от фагоцитоза клетками иммунной системы хозяина. Этот восковой барьер также предотвращает проникновение пятен в клетку, поэтому окраска по Граму не работает с микобактериями, такими как Mycobacterium , которые являются патогенами людей и животных. Для этих бактерий применяется метод окрашивания acid — fast .

Рисунок 6. Кислотоустойчивые бациллы в мокроте.

Для проведения кислотостойкого окрашивания термостатированный мазок заливают основным красителем карбол фуксином, а предметное стекло нагревают на водяной бане с паром.Тепло «плавит» восковую клеточную стенку и позволяет клеткам поглощать краситель. Затем слайду дают остыть и добавляют раствор кислоты и спирта в качестве обесцвечивающего средства. Клетки, которые являются «кислотоустойчивыми» из-за миколовой кислоты в их клеточной стенке, сопротивляются обесцвечиванию и сохраняют первичное окрашивание. Все остальные типы клеток обесцвечиваются. Затем метиленовый синий используется в качестве контрастного красителя. В конце концов, кислотоустойчивые бактерии (КУБ) будут окрашены в ярко-розовый цвет, а все другие типы клеток станут синими.

Методы окрашивания для выделения специфических клеточных структур

Капсула : полисахаридная слизь, окружающая некоторые виды бактерий и несколько типов эукариотических микробов, лучше всего визуализируется при отрицательном окрашивании клеток. В этом методе бактерии сначала смешиваются с пятном, а затем капля смеси распределяется по поверхности предметного стекла в виде тонкой пленки. При использовании этого метода капсулы выглядят как прозрачный слой вокруг бактериальных клеток с темным фоном.

Metachromatic гранулы или другие интрацитоплазматические тельца : Некоторые бактерии могут содержать накопительные тельца, которые можно окрашивать. Одним из примеров является грамположительная палочка Corynebacterium , которая накапливает фосфат в структурах, называемых «волютин», или метахроматических гранулах, находящихся внутри клеточной мембраны. Для визуализации внутрицитоплазматических тел у бактерий используются различные методы окрашивания, которые часто дают ключ к идентификации при наблюдении в клетках.

Эндоспорное пятно

Эндоспоры — это спящие формы живых бактерий, и их не следует путать с репродуктивными спорами, продуцируемыми грибами. Эти структуры производятся несколькими видами грамположительных бактерий, почти всеми бациллами, в ответ на неблагоприятные условия окружающей среды. Две распространенные бактерии, продуцирующие эндоспоры, — это Bacillus или Clostridum . Оба живут в основном в почве и как симбионты растений и животных, и продуцируют эндоспоры, чтобы выжить в быстро и часто меняющейся среде.

Процесс эндоспоруляции (образование эндоспор) включает несколько этапов. После того, как бактериальная клетка реплицирует свою ДНК, образуются слои пептидогликана и белка, окружающие генетический материал. После полного формирования эндоспора высвобождается из клетки и может бездействовать в течение нескольких дней, недель или лет. Когда преобладают более благоприятные условия окружающей среды, эндоспоры прорастают и возвращаются к активной работе в качестве вегетативных клеток.

Зрелые эндоспоры обладают высокой устойчивостью к условиям окружающей среды, таким как тепло и химические вещества, и это позволяет бактериям выжить в течение очень долгого времени.Эндоспоры, образовавшиеся миллионы лет назад, были успешно возвращены к жизни, просто обеспечив их водой и пищей.

Поскольку оболочка эндоспор очень устойчива к окрашиванию, был разработан специальный метод, чтобы их было легче увидеть в светлопольном микроскопе. Этот метод, называемый красителем endospore , использует либо нагревание, либо длительное время воздействия, чтобы побудить эндоспоры принять первичное пятно, обычно водорастворимый краситель, такой как малахитовый зеленый, поскольку эндоспоры проницаемы для воды.После этапа обесцвечивания, который удаляет краситель из вегетативных клеток в мазке, наносится контрастное сафранин для обеспечения цвета и контраста. При окрашивании этим методом эндоспоры становятся зелеными, а вегетативные клетки окрашиваются в розовый цвет, как показано на Рисунке 7.

Рисунок 7. Бактериальные клетки с эндоспорами, окрашенные методом окраски эндоспор. Рисунок 8. Бациллы с эндоспорами, просматриваемые с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Хотя сами эндоспоры устойчивы к методу окрашивания по Граму, бактериальные клетки, захваченные в процессе создания этих структур, могут быть окрашены.В этом случае эндоспоры выглядят как четкие овальные или сферические области внутри окрашенной клетки. Эндоспоры также можно непосредственно наблюдать в клетках с помощью фазово-контрастной микроскопии, как показано на Рисунке 8.

Поскольку многие методы дифференциального окрашивания требуют нескольких этапов и длительного времени, мы не будем выполнять все методы дифференциального окрашивания, описанные выше.

Предварительно окрашенные слайды будут использоваться для визуализации бактериальных капсул, метахроматических гранул и кислотоустойчивых бацилл.Возьмите по одному слайду каждой из трех бактерий, перечисленных в таблице ниже. Просматривая эти слайды, обращайте внимание на «выделенные» структуры. У вашего изолята из окружающей среды может быть одна или несколько из этих клеточных функций, и умение распознавать их поможет в идентификации. Все это следует рассматривать с помощью масляной иммерсионной линзы объектива.

Пятно по грамму

Все процедуры окрашивания следует проводить над раковиной.Будет продемонстрирована процедура окрашивания по Граму, а ее обзор представлен в таблице 1.

Доброволец с вашего лабораторного стола должен получить культуры бактерий, которые вы будете использовать в этой лаборатории, в соответствии с указаниями вашего инструктора.Одна из культур будет грамположительной бактерией, а другая — грамотрицательной. Ниже напишите названия бактерий, которые вы будете использовать, вместе с BSL для каждой культуры:

__________________________________________________________________________________

Возьмите два предметных стекла и приготовьте мазок каждой из двух бактериальных культур, по одному на предметное стекло, как показано. Дайте ПОЛНОСТЬЮ высохнуть на воздухе и закрепите при нагревании. Окрашивайте оба мазка методом окраски по Граму.Наблюдайте за предметными стеклами с помощью светового микроскопа при увеличении в 1000 раз и запишите свои наблюдения в таблице ниже.

Пятно по Граму «Заключительный экзамен»: приготовьте мазок, содержащий смесь грамположительных И грамотрицательных бактерий, добавив небольшое количество каждой бактерии в одну каплю воды на предметном стекле.Тепло зафиксируйте мазок и окрасите его по Граму. Вы должны быть в состоянии определить реакцию окрашивания по Граму, клеточную морфологию и расположение ОБЕИХ бактерий в этом смешанном мазке. Ваш преподаватель может попросить показать этот слайд и предложить конструктивный комментарий.

Эндоспорное пятно

Лишь несколько родов бактерий продуцируют эндоспоры, и почти все они являются грамположительными бациллами. Наиболее заметными являются виды Bacillus и Clostridium , которые естественным образом обитают в почве и являются обычными загрязняющими веществами на поверхности.Рост Clostridium spp. обычно ограничивается анаэробной средой; Bacillus spp. может расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Эндоспорообразующие бактерии отличаются от других групп грамположительных бацилл и различаются по их эндоспорам.

Обзор процедуры окрашивания эндоспор представлен в таблице 2.

После окрашивания эндоспоры обычно выглядят как светло-зеленые овальные или сферические структуры, которые можно увидеть внутри или за пределами вегетативных клеток, которые выглядят розовыми.

Форма и расположение эндоспор внутри бактериальных клеток, а также то, расширяет ли спорангий (D) или не расширяет (ND) стороны клетки, являются важными характеристиками, которые помогают в дифференциации между видами (см. Рисунок 9) .

Рисунок 9

1. Овальный, центральный, не растянутый (ND)
2. Овальный, концевой, ND (и параспоральный кристалл)
3. Овальный, концевой, растянутый (D)
4. Овальный, центральный, D
5. Сферический, концевой, D
6. Овальный, боковой, D

Эндоспоры довольно устойчивы к большинству процедур окрашивания; однако в мазках с обычным окрашиванием они могут быть видны как «очертания» с чистым пространством внутри. Если вы наблюдаете «очертания» или то, что кажется «призраками» клеток в мазке, окрашенном по Граму, грамположительных бацилл, то также следует выполнить окрашивание эндоспор, чтобы подтвердить наличие или отсутствие эндоспор.

Волонтер из вашего лабораторного стола должен получить бактериальные культуры для окрашивания эндоспор в соответствии с указаниями вашего инструктора. Обратите внимание, что все это будут виды Bacillus . Приготовьте мазки и окрасьте каждый, используя технику окрашивания эндоспор. Посмотрите на слайды и обратите внимание на форму и расположение эндоспоры, а также на внешний вид спорангия (опухший или не опухший) в таблице ниже:

Кроме того, выберите ОДНУ из указанных выше культур и окрасите ее по Граму.Запишите свои результаты ниже в отведенных местах:

Название культуры, окрашенной по Граму: __________________________________________________

Реакция окрашивания по Граму и клеточная морфология: ______________________________________

Видны ли эндоспоры в мазке, окрашенном по Граму? _________________ Если вы видите эндоспоры, опишите, как они выглядят в препарате, окрашенном по Граму, и чем он похож и отличается от того, что вы видите в препарате, окрашенном по Граму.

Принцип, процедура, интерпретация, примеры и анимация

Окрашивание по Граму — это распространенный, важный и наиболее часто используемый метод дифференциального окрашивания в микробиологии, который был введен датским бактериологом Гансом Кристианом Грамом в 1884 году. Этот тест позволяет дифференцировать бактерии на грамположительные и Грамотрицательные бактерии, которые помогают в классификации и дифференциации микроорганизмов.

Принцип окрашивания по Граму

Когда бактерии окрашиваются первичным красителем Crystal Violet и фиксируются протравкой, некоторые бактерии могут сохранять первичное окрашивание, а некоторые обесцвечиваются спиртом.Клеточные стенки грамположительных бактерий имеют толстый слой белково-сахарных комплексов, называемых пептидогликанами, а содержание липидов невелико. Обесцвечивание клетки заставляет эту толстую клеточную стенку обезвоживаться и сокращаться, что закрывает поры в клеточной стенке и предотвращает выход пятна из клетки. Таким образом, этанол не может удалить комплекс кристаллического фиолетового и йода, который связан с толстым слоем пептидогликана грамположительных бактерий и имеет синий или фиолетовый цвет.

В случае грамотрицательных бактерий клеточная стенка также поглощает комплекс CV-йод, но из-за тонкого слоя пептидогликана и толстого внешнего слоя, который образован липидами, комплекс CV-йод смывается.Когда они подвергаются воздействию алкоголя, обесцвечивающее средство растворяет липиды в клеточных стенках, что позволяет комплексу кристаллический фиолетовый-йод вымываться из клеток. Затем, когда они снова окрашиваются сафранином, они забирают пятно и приобретают красный цвет.

  Реагенты, используемые при окрашивании по Граму  

• Кристаллический фиолетовый, первичное окрашивание
• Йод, протрава
• Обесцвечивающее средство на основе ацетона и спирта (95%)
• Сафранин, контрастное пятно

Методика Грама Окрашивание

1. Возьмите чистое, обезжиренное предметное стекло.
2. Приготовьте мазок суспензии на чистом предметном стекле с петлей образца.
3. Сушка на воздухе и закрепление нагреванием.
4. Кристаллический фиолетовый залили и выдержали от 30 секунд до 1 минуты и промыли водой.
5. Залейте грамм йодом в течение 1 минуты и промойте водой.
6. Затем промойте 95% спиртом или ацетоном в течение 10-20 секунд и ополосните водой.
7. Добавьте сафранин примерно на 1 минуту и ​​промойте водой.
8. Высушите на воздухе, промокните и наблюдайте под микроскопом.

  Интерпретация  

грамположительных: синий / фиолетовый цвет
грамм отрицательных: красных цветов

  Примеры  

грамположительных бактерий: Actinomyces, Cloridocneteria, Bacillium, Bacillium , Lactobacillus, Listeria, Mycoplasma, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces и др.
грамотрицательных бактерий: Escherichia coli ( E.coli ), Salmonella , Shigella и другие Enterobacteriaceae, Pseudomonas , Moraxella , Helicobacter , Stenotrophomonas , , Bdellovibrio acidum, бактерии Bdellovibrio и т. д.

Загрузите анимацию снизу: Анимация окрашивания по граммам

Frontiers | Оценка методов окрашивания по граммам и жизнеспособности для количественной оценки динамики бактериального сообщества с использованием проточной цитометрии

Введение

Микробиота кишечника человека состоит из широкого спектра микроорганизмов, включая бактерии, археи, грибы, вирусы и дрожжи (Lozupone et al., 2012; Dieterich et al., 2018). Бактерии являются наиболее изученными микроорганизмами, их количество составляет около 10 ¹¹ бактерий на грамм стула и преобладают Firmicutes и Bacteroidetes (Qin et al., 2010). Анализ микробиоты кишечника привел к концепции энтеротипов, которые делят микробиоту человека на основе обогащения конкретных таксонов (Arumugam et al., 2011; Wu et al., 2011). На разнообразную и специфичную для каждого человека микробиоту кишечника могут влиять различные факторы, такие как возраст, пол, заболевания, лекарственные препараты, окружающая среда или питание (Lozupone et al., 2012). Также было показано, что ряд нарушений связан с измененным составом кишечной микробиоты (Lin and Zhang, 2017). Основываясь на этих наблюдениях, концепция пробиотиков следующего поколения (NGP) вызвала интерес. Он основан на использовании видов бактерий, принадлежащих к комменсальным родам, таким как Akkermansia , Christensenella или продуцентам бутирата Faecalibacterium , Roseburia и Eubacterium для восстановления равновесия кишечной микробиоты.Эти виды проявили потенциальный интерес благодаря противовоспалительным свойствам (Chang et al., 2019). Другая стратегия модуляции или коррекции дисбиотической микробиоты включает трансплантацию фекальной микробиоты (FMT), которая оказалась высокоэффективной при лечении рецидивирующих инфекций, вызванных Clostridioides difficile (Quraishi et al., 2017; Ianiro et al., 2018). Между тем, продолжается большое количество испытаний, изучающих другие потенциальные терапевтические применения (Allegretti et al., 2019).

Реакция сложных микробных сообществ на различные факторы, включая окружающую среду, образ жизни, пищевые привычки, пищевые добавки или медикаментозное лечение, часто исследуется с использованием ферментационных систем in vitro (Geirnaert et al., 2017), состоящий из нескольких реакторов, имитирующих различные части желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (Williams et al., 2015). Молекулярные методы, основанные на кПЦР или секвенировании следующего поколения (NGS), обычно используются для анализа состава микробиоты кишечника. Обладая преимуществом обнаружения «некультивируемых» микроорганизмов, обычные технологии NGS обладают определенными недостатками, такими как необходимость ожидания в течение нескольких дней или даже недель перед получением отчетов, если секвенирование выполняется на стороне или выполняется платформой, или отсутствие метаболической активности. мониторинг.Это важное ограничение для ежедневного наблюдения за ферментацией или для исследования / оптимизации параметров культуры в экспериментальных и промышленных условиях. С другой стороны, о большом потенциале цитометрии как инструмента для быстрого анализа кишечной микробиоты сообщалось с момента ее разработки в 1990-х годах (van der Waaij et al., 1994). Его часто использовали в сочетании с флуоресцентно меченными зондами для нацеливания рРНК 16s, называемыми методом Flow-FISH (флуоресцентная гибридизация In situ ), для анализа состава кишечной микробиоты (Thomas et al., 2002; Мюллер и др., 2006). Этот аналитический инструмент все чаще используется в последние годы для анализа сложных экосистем, а также в качестве дополнительного инструмента к секвенированию для предварительного отбора образцов путем изучения концентраций микробных сообществ или мониторинга нежелательного бактериального роста (Perst et al., 2014). Сигналы прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) зависят от физических свойств анализируемых частиц и могут быть объединены с измерением автофлуоресценции для оценки изменений микробных сообществ без какого-либо окрашивания (Dhoble et al., 2016). Однако окрашивание образцов предлагает многопараметрический анализ, дающий более глубокую информацию об исследуемом сообществе (Buysschaert et al., 2016). В контексте бактериального анализа в основном используются окраски нуклеиновых кислот, а также лектины, меченые антибиотики или специфические красители для оценки мембранного потенциала или метаболической активности (Muller and Nebe-von-Caron, 2010). 4 ‘, 6-диамидино-2’-фенилиндол (DAPI), флуоресцентный краситель, который связывается с последовательностями двухцепочечной ДНК, богатыми AT, использовался в сочетании с FCM во многих приложениях и позволил идентифицировать конкретные подгруппы сложных сообществ в окружающей среде. образцы (Koch et al., 2013), кишечной микробиоты (Zimmermann et al., 2016) или микробиоты слюны (van Gelder et al., 2018). Совсем недавно Krause et al. (2020) использовали его, чтобы проследить динамику упрощенной микробиоты человека, состоящей из восьми видов бактерий, в ферментере. Однако использование DAPI требует УФ-лазера для возбуждения, который является дорогостоящим и, следовательно, менее доступным, чем другие лазеры. Таким образом, мы были заинтересованы в исследовании дополнительных методов окрашивания, которые предполагают использование более доступных лазеров, обычно используемых в проточных цитометрах.Другие окраски нуклеиновых кислот, включая Syto 9, SYBR Green I, а также Syto 24 и йодид пропидия (PI), часто используются для оценки жизнеспособности бактерий (Berney et al., 2007; Nescerecka et al., 2016; Chiron et al., 2018 ). Готовый к использованию набор Live / Dead ^® BacLight ^TM для определения жизнеспособности бактерий, сочетающий красители Syto 9 и PI, позволил быстро оценить жизнеспособность бактерий. Однако ранее при окрашивании ИП были получены вводящие в заблуждение результаты (Stiefel et al., 2015). Другие стратегии, в которых используется комбинация красителей нуклеиновых кислот Syto13 и гексидия йодида (HI), также были продемонстрированы для идентификации грамположительных бактерий в смесях чистых культур (Mason et al., 1998). Также были описаны методы окрашивания по Граму с использованием агглютинина зародышей пшеницы (WGA), лектина, который связывается со специфическими углеводами (De Hoff et al., 2009), включая N, -ацетилглюкозамин и N -ацетилнейраминовых остатков. в слое пептидогликана (Wittmann, Pieters, 2013). Лектин WGA также использовался для идентификации грамположительных бактерий в смешанных культурах известных бактерий (Ruger et al., 2012). Меченый ванкомицин также ранее использовался для подобных применений, включая анализ грамположительных бактерий из микробиоты кишечника мышей с помощью микроскопии (Wang et al., 2017). Этот антибиотик обладает способностью ингибировать синтез клеточной стенки путем связывания с C-концевыми остатками D-аланин-D-аланина предшественников пептидогликана (van Hoek et al., 2011), но молекула слишком велика, чтобы проникнуть через внешнюю мембрану Грамотрицательные бактерии (Fernandes et al., 2017).

Чтобы определить процедуры окрашивания, которые будут применимы к целому ряду микробных сред, это была особая потребность, выраженная во время семинаров конференции CYTO 2018 (Czechwska et al., 2019), мы исследовали использование специального метода окрашивания в сочетании с FCM для быстрой характеристики и мониторинга сложных экосистем, полученных в результате ферментации in vitro . Мы сосредоточились на окрашивании по Граму с комбинацией меченых WGA и ванкомицина и оценке соотношения живых / мертвых бактерий. Методы были разработаны и проверены на чистых культурах аэробных и факультативных или строго анаэробных бактерий перед их использованием в сложных экосистемах.

Материалы и методы

Этика

Фекальный материал был анонимно собран компанией MaaT Pharma у здоровых добровольцев.В соответствии со статьей L1243-3 Французского Кодекса здравоохранения документы с описанием коллекции были поданы под номером DC-2016-2609. Доноры были проинформированы о том, что никакая личная информация и анализ человеческого материала не будут проводиться и, как следствие, что никакая информация не может быть предоставлена ​​относительно использования их пожертвований. Дело было принято французскими властями 15 мая 2016 года.

Бактериальные штаммы и питательные среды

Всего в экспериментах было использовано 54 штамма, включая 40 аэробных / факультативно-анаэробных штаммов и 14 строго анаэробных штаммов, соответствующих в общей сложности 20 видам.Аэробные штаммы культивировали при 37 ° C и перемешивании при 180 об / мин. Анаэробные комменсальные штаммы выращивали при 37 ° C с использованием анаэробной камеры (BACTRON 600 — Sheldon), заполненной атмосферой 90% N ₂ + 5% H ₂ + 5% CO ₂ . Анаэробная атмосфера была подтверждена с помощью цветных индикаторов резазурина (BR0055 — Oxoid). Питательные среды, PBS и все другие материалы, используемые для культивирования, помещали в камеру по крайней мере за 48 часов до использования для снижения до анаэробных условий.

Среды

Brain heart Infusion (BHI) и Luria Berthani (LB) использовали для грамположительных и грамотрицательных аэробных / факультативных анаэробных штаммов.Модифицированная анаэробная среда Gifu (mGAM, Hyserve) использовалась для строго анаэробных штаммов и была дополнена либо 30% бычьего рубца (mGAMr), либо 0,1% целлобиозы, 0,1% инулина, 0,25% муцина и 30% рубца крупного рогатого скота (mGAM CRIM). Все штаммы и соответствующие им питательные среды представлены в таблицах 1, 2.

Таблица 1. Штаммы аэробных / факультативных анаэробных бактерий, питательные среды и граммовый статус.

Таблица 2. Штаммы строго анаэробных бактерий, питательные среды и граммовый статус.

Этикеточные пятна

Лектин Alexa-Fluor 647 ^® Агглютинин зародышей пшеницы (WGA-647 — Invitrogen — W32466) суспендировали в стерильной дистиллированной воде с получением исходного раствора с концентрацией 1 мг / мл. Исходный раствор ванкомицина Bodipy-FL (Van-Bodipy, Invitrogen — V34850) готовили в ДМСО в концентрации 0,5 мг / мл. Аликвоты обоих исходных растворов хранили при -20 ° C. Для анализа по Граму также использовали набор LIVE BacLight ^TM для бактериального окрашивания по Граму (Invitrogen — L7005) в соответствии с рекомендациями производителя.Этот набор состоит из Syto 9 и HI в концентрации 3,34 и 4,67 мМ соответственно. Для анализа жизнеспособности использовали набор Live / Dead ^® BacLight ^TM для определения жизнеспособности бактерий (Invitrogen — L34856) в соответствии с рекомендациями производителя. Этот набор состоит из Syto 9 (3,34 мМ в ДМСО) и йодида пропидия (PI) (20 мМ в ДМСО), двух красителей нуклеиновых кислот, которые окрашивают все бактерии и, предпочтительно, бактерии с поврежденной клеточной стенкой, которые считаются «мертвыми, ”Соответственно (Berney et al., 2007).

Анализ проточной цитометрии

Сортировщик клеток Influx ^® (BD) был использован для цитометрического анализа. Он оснащен лазером 488 нм (мощность 200 мВт), лазером 405 нм (мощность 100 мВт) и лазером 640 (мощность 120 мВт) для получения сигналов прямого (FSC) и бокового рассеяния (SSC) на длине волны 488 нм. Флуоресценцию Syto 9, PI и HI возбуждали лазером 488 нм и собирали через полосовой фильтр 540/30 нм (BP) для Syto 9 и BP 670/30 нм как для PI, так и HI. Компенсация не применялась при использовании Syto 9 и PI или Syto 9 и HI из-за низкого или даже отсутствия перелива флуоресценции, испускаемой в используемой полосе пропускания.Флуоресценцию Van-Bodipy возбуждали лазером 488 нм и собирали через BP 540/30 нм. Флуоресценцию WGA-647 возбуждали лазером 640 нм и собирали через BP 670/30 нм. При использовании двух разных лазеров для возбуждения Van-Bodipy и WGA-647 компенсация не применялась при использовании обоих красителей. Перед запуском образцов корректировка масштабирования площади и контроль качества выполнялись с помощью радужных шариков (Invitrogen — L34856), а скорость потока поддерживалась на уровне 100–150 событий в секунду.Анализ образцов проводился при скорости потока около 500–2000 событий / сек. Общее количество зарегистрированных частиц составило 50 000 событий.

Анализ данных и стробирование выполняли с использованием программного обеспечения FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, США). Количественное определение бактерий проводили с использованием стандартных шариков микросфер (Invitrogen — L34856). Фоновый шум был устранен путем рассмотрения только событий со значениями FSC выше 10 ¹ . Чтобы отличить клетки от фона в анализе жизнеспособности, использовали ворота для обнаружения бактерий.Только события с положительной флуоресценцией Syto 9 относились к бактериям (дополнительный рисунок S1). Для определения жизнеспособности ворота были установлены на основе обработанного изопропанолом контроля (дополнительный рисунок S1). Жизнеспособность рассчитывали как количество «жизнеспособных» клеток по отношению к общему количеству клеток («жизнеспособных» и «нежизнеспособных» клеток). Для доли Грама ручное стробирование выполнялось для видимых групп населения.

Оптимизация окрашивания по Граму в проточной цитометрии

Ночные культуры Bacillus subtilis ATCC 23857, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis Jh3.2, Lactococcus lactis ATCC 11454, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Salmonella enterica typhimurium ATCC 13311 и Escherichia coli ATCC 35218, оптическая плотность (OD ₆₀₀ ) была установлена ​​на оптическую плотность (OD ₆₀₀ ). Ultrospec 10 cell Density), что соответствует от 1,0 × 10 ⁸ до 1,0 × 10 ⁹ клеток на мл в зависимости от вида. Бактерии подвергались воздействию 1) 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2 или 4 мкг / мл Van-Bodipy, 2) равная смесь Van-Bodipy и немеченого ванкомицина (Van) в концентрации 1, 2, 4 и 8 мкг / мл или 3) 10, 20, 30, 50, 60, 80 или 100 мкг / мл конечных концентраций WGA-647 в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре.Комбинация обоих красителей Van-Bodipy / Van и WGA-647 также была исследована с их необходимыми концентрациями с 1 М KCl или без него, что, как было показано, улучшает окрашивание WGA-647 (Holm and Jespersen, 2003). Стадия промывки (центрифугирование при 10000 g в течение 5 минут) была добавлена ​​для удаления несвязавшихся пятен. Образцы суспендировали в 200 мкл PBS и затем анализировали с использованием сортировщика клеток Influx ^® , как описано выше.

Влияние фиксации на окрашивание по Граму

Ночные культуры грамположительных и грамотрицательных бактерий доводили до OD ₆₀₀ , равного 0.5 на основе измерения спектрофотометра. Культуры либо разбавляли PBS, либо 1 M KCl, а затем подвергали воздействию 1% параформальдегида (PFA) или 95% этанола в течение 1 ч при комнатной температуре. После двух стадий отмывки в PBS окрашивание обоими Van-Bodipy / Van / WGA-647 при их оптимальной концентрации 2/2/20 мкг / мл было затем выполнено либо в 1 M KCl, либо в PBS в течение 15 минут, в темноте при комнатная температура. Перед анализом FCM выполняли стадию промывки.

Скрининг по грамму аэробных / факультативных анаэробных штаммов и строго анаэробных бактерий

Ночные культуры доводили до OD ₆₀₀ 0.5 для аэробных / факультативных анаэробных бактерий на основе измерений спектрофотометра или в диапазоне от 10 ⁵ до 10 ⁷ событий / мл на основе количественного анализа проточной цитометрии для строго анаэробных бактерий. Использовали смесь Van-Bodipy / Van / WGA-647 при их оптимальных концентрациях 2/2/20 мкг / мл в 1 М KCl. После 15 мин окрашивания при комнатной температуре в темноте бактерии промывали PBS перед анализом FCM. Окрашивание проводили в трех биологических повторностях.

Классическое окрашивание по Граму

кристаллическим фиолетовым и сафранином проводили параллельно (набор для окрашивания 77730 по Граму, Sigma-Aldrich), и предметные стекла наблюдали с помощью 100-кратного масляного иммерсионного объектива.

Коммерчески доступный набор LIVE BacLight ^TM Bacterial Gram Stain Kit, сочетающий Syto 9 и HI, использовали, как рекомендовано производителем, для ночных культур E. coli BL21, E. faecalis ATCC 29212 и S. variabile DSM 15146 скорректирован в диапазоне от 10 ⁵ до 10 ⁷ событий / мл на основе количественной оценки проточной цитометрии.

Оценка живого / мертвого окрашивания, анаэробная сортировка отдельных штаммов

Для оценки культивирования «жизнеспособных» и «нежизнеспособных» фракций бактериальные клетки были отсортированы в соответствии с их статусом окрашивания «живые / мертвые», а затем культивированы в анаэробных условиях.Для этого сортировщик клеток Influx ^® был модифицирован, как описано ранее (Thompson et al., 2015). Вкратце, перчаточный ящик был подключен к сортировочной камере, создавая воздухонепроницаемую среду вокруг сортировочного потока. Азот продувался внутри перчаточного ящика для снижения концентрации кислорода ниже 0,8%, как показано датчиком ToxiRAE Pro (PGM-1860 — системы RAE).

Бактерии, использованные для экспериментов по сортировке, культивировали в анаэробных условиях в течение 24 или 48 часов при 37 ° C на чашках с mGAMr. Затем одну колонию субкультивировали в бульоне mGAMr или бульоне mGAM CRIM ( A.muciniphila и C. minuta ) в течение 24 ч на срок до 5 дней. Время культивирования определяли в зависимости от кинетики кривой роста каждого тестируемого штамма для достижения стационарной фазы и получения смеси клеток, окрашенных Syto 9 и Syto 9 / PI, позволяющей выполнить сортировку «жизнеспособных» и «нежизнеспособных». »Фракции. Бактерии были отрегулированы в диапазоне от 10 ⁷ до 10 ⁸ событий / мл на основе количественного анализа проточной цитометрии и окрашены в восстановленном PBS (0,5 мг / л резазурина, 2.1 мМ солидиевой серы и 2,8 мМ L ( -цистеин HCl) с Syto 9 и PI в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре при конечной концентрации 5 мкМ и 30 мкМ соответственно. Затем окрашенные образцы промывали и ресуспендировали в восстановленном PBS и покрывали 500 мкл парафинового масла для предотвращения воздействия кислорода перед анализом FCM. Предварительно восстановленная агаровая среда mGAMr, приготовленная в однолуночных планшетах Nunc OmniTray (Thermo Scientific), была запечатана в GenBag перед переносом из анаэробной камеры в перчаточный бокс сортировщика клеток.Сортировка производилась на этих пластинах с помощью модели 14 × 8, состоящей из 14 столбцов и 8 строк. Бактерии, окрашенные Syto 9 и Syto 9 / PI, сортировали в трех экземплярах, следуя схеме сортировки: 1, 3, 10, 30, 100, 300 и 1000 событий на пятно с функцией «одна капля — одна». Скорость потока была отрегулирована до 1000 событий / сек. По окончании сортировки чашки с агаром снова закрывали в GenBag перед переносом в анаэробную камеру на 24–48 ч инкубации при 37 ° C.

Среда для сбора образцов кала и ферментации

образцов стула были собраны анонимно у здоровых добровольцев, как указано в разделе «Этика».На основе секвенирования репертуара гена 16S рРНК три образца фекалий F1, F2 и F3, представляющих три описанных энтеротипа (Arumugam et al., 2011), были использованы для экспериментов по ферментации, выполненных со средой mGAM, традиционно используемой для культивирования комменсальных анаэробных бактерий (Gotoh et al., 2017) и ранее использовались в экспериментах по ферментации (Takagi et al., 2016).

Micro-24

^® Параметры микробиореактора и отбор проб

Периодическую ферментацию проводили в 24-луночной кассете Micro-24 ^® (MRT-PRC, Pall) с использованием специальных колпачков, позволяющих ограничить внешний газообмен.Культуральная среда и образцы фекалий F1, F2 и F3 обрабатывались в анаэробной камере. После добавления 5 мл культуральной среды в каждую независимую лунку кассеты проводили калибровку pH, как описано производителем. Вкратце, инкубацию кассеты только с культуральной средой в течение ночи проводили при 37 ° C при соответствующей подаче газа для поддержания анаэробных условий. После инкубации было проведено автономное измерение pH для расчета смещения, применяемого в управляющем программном обеспечении микробиореактора Micro-24 ^® .Затем в соответствующие лунки добавляли по 25 мкл каждого размороженного образца фекалий. Кассету Micro-24 ^® загружали в Micro-24 ^® и начинали ферментацию. Программное обеспечение Micro-24 ^® непосредственно контролирует pH, температуру и подачу газа. Каждый эксперимент проводили при 37 ° C, при орбитальном перемешивании со скоростью 650 об / мин и в анаэробных условиях, которые поддерживались подачей газа из смеси CO ₂ / N ₂ (75/25). PH регулировали на уровне 6.2 или 6.5 с питанием NH ₃ .

Для каждого образца фекалий условия ферментации были выполнены в трех экземплярах. В каждый момент отбора проб (24, 48 и 72 ч) собирали 500 мкл образцов для оценки количества, жизнеспособности и доли по Граму с помощью проточной цитометрии и выполнения анализа секвенирования. Анализ жизнеспособности и граммовой доли выполняли, как описано ранее, а количественную оценку выполняли с использованием стандартных микросфер (Invitrogen).

Экстракция ДНК, секвенирование и биоинформатический анализ

Образцы ферментации, собранные через 24 и 48 ч, были отобраны для секвенирования гена 16S рРНК.Геномная ДНК была экстрагирована Eurofins Genomics из образцов с использованием набора NucleoSpin Soil (Macherey Nagel). Библиотеку секвенирования, нацеленную на область V3-V4 гена 16S рРНК, конструировали для каждого образца с использованием MyTaq HS-Mix (Bioline) в соответствии с инструкциями производителя. Затем библиотеки секвенировали в прогонах MiSeq v3 (Illumina) с парными концами (2 × 300 п.н.). После слияния ампликонов с использованием FLASH (Magoc and Salzberg, 2011) чтения были отфильтрованы по качеству с помощью Trimmomatic (Bolger et al., 2014).Затем ампликоны были сгруппированы в OTU с порогом идентичности 97%, и каждому OTU была назначена таксономическая аннотация с помощью VSEARCH (Rognes et al., 2016) и базы данных Silva SSU Release 128. Для сравнения данных количество последовательностей был нормализован до 60 000 ампликонов на образец. Индексы α- и β-разнообразия были рассчитаны с использованием статистического программного обеспечения R (R Core Team, 2015, версия 3.4.4) с использованием пакетов Vegan и phyloseq. Для оценки изменчивости индексов α-разнообразия (богатства, Шеннона, обратного Симпсона) использовалось 20 подвыборок на выборку.Анализ главных координат β-разнообразия (PCoA) был создан с использованием меры несходства Брея-Кертиса. Секвенирование гена 16S рРНК проводили в трех повторах, за исключением двух образцов фекалий F2 и F3, полученных после 48 ч ферментации, при условии, что условия культивирования регулируются при pH 6,5, для которых анализ проводили на дубликатах.

Сравнение пропорций грамположительных и грамотрицательных бактерий, измеренных с помощью FCM, с пропорциями, оцененными на основе секвенирования репертуара 16S рРНК

Мы сравнили доли грамположительных и грамотрицательных бактерий, обнаруженных в сложной микробиоте, с использованием анализа FCM с предполагаемым отнесением по Граму каждой OTU на уровне рода (дополнительная таблица S1 для отнесения по Граму).Для профилирования микробиома использовались два разных расчета: классический подход относительной численности, описанный в разделе 2.11 этой рукописи, и количественный подход микробиома, описанный Vandeputte et al. (2017). В этом методе предлагается рассчитать глубину секвенирования с корректировкой числа копий гена 16S рРНК, разделенную на количество клеток в образце, чтобы учесть различия в количестве копий гена 16S рРНК между видами и различия в микробной нагрузке между образцами. Среднее количество оперонов было получено из базы данных rrndb (Stoddard et al., 2015) для каждой OTU на уровне рода, приближаясь к ближайшему филогенетическому уровню, когда род не был в базе данных (дополнительная таблица S1 для числа копий гена 16S рРНК, используемая для каждой OTU).

Статистический анализ

Все данные ферментации, включая цитометрию и секвенирование, выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.

Результаты

Оптимизация концентраций Van-Bodipy и WGA-647 для улучшения дифференциации по Граму

Были исследованы разные концентрации обоих меченых красителей Van-Bodipy и WGA-647 для определения наилучших условий окрашивания, позволяющих отличить грамположительные бактерии от грамотрицательных.Использовали ночные культуры B. subtilis ATCC 23857, E. faecalis Jh3.2 и K. pneumoniae ATCC 700603, скорректированные до OD ₆₀₀ 0,5. Незначительные различия наблюдались на грамположительных бактериях с концентрациями 0,1 и 0,2 мкг / мл Van-Bodipy (данные не показаны). Окрашивание E. faecalis Jh3.2 улучшалось при постепенном увеличении концентраций Van-Bodipy с 0,5 до 4 мкг / мл со средними геометрическими значениями флуоресценции Van-Bodipy, увеличивающимися с 5 до 38.5, тогда как не было значительного улучшения для B. subtilis ATCC 23857, для которого средние геометрические значения флуоресценции Van-Bodipy были лишь немного увеличены с 2,8 до 4,6 (рис. 1A). Грамотрицательные виды K. pneumoniae ATCC 700603 оставались неокрашенными Van-Bodipy, независимо от используемых концентраций, со средними геометрическими значениями флуоресценции Van-Bodipy около 1,1.

Рисунок 1. Оптимизация флуоресцентного мечения для распознавания грамположительных и грамотрицательных бактерий.Были исследованы различные концентрации Van-Bodipy и WGA-647. Ночные культуры тестируемых бактерий B. subtilis ATCC 23857, E. faecalis Jh3.2 и K. pneumoniae ATCC 700603 доводили до OD ₆₀₀ 0,5. Различные окрашивания проводили в течение 15 минут при комнатной температуре с различными концентрациями (A), Van-Bodipy, (B), Van-Bodipy / Van и (C), WGA-647. Более высокие концентрации представлены более темным серым цветом (A) 0.5; 1; 2 или 4 мкг / мл, (B) 1, 2, 4 и 8 мкг / мл и (C) конечные концентрации 10, 20, 30, 50, 60, 80 или 100 мкг / мл. Неокрашенные виды бактерий представлены черными пунктирными линиями.

Смеси равных количеств немеченого ванкомицина и Van-Bodipy были протестированы для улучшения окрашивания B. subtilis , как сообщалось ранее (Tiyanont et al., 2006). Были исследованы конечные концентрации Van-Bodipy / Van от 1 до 8 мкг / мл. Как ранее наблюдалось с одним только Van-Bodipy, окрашивание E.faecalis был улучшен с увеличением концентрации, средние геометрические значения флуоресценции Ван-Бодипи / Ван увеличились с 8,5 до 59,7 (рис. 1В). Однако эта стратегия не улучшила окрашивание ни для B. subtilis , ни для E. faecalis по сравнению с одним только Van-Bodipy. Поэтому процедура окрашивания использовалась как смесь Van-Bodipy / Van. Это позволило снизить количество меченого ванкомицина и сохранить эффективность окрашивания при той же конечной концентрации.При концентрации 4 мкг / мл Van-Bodipy, используемый отдельно или в комбинации с немеченым ванкомицином, позволил получить средние геометрические значения флуоресценции для окрашивания E. faecalis , равные 34,5 и 38,5, соответственно.

Повышение концентрации WGA-647 с 10 до 100 мкг / мл немного улучшило окрашивание грамположительных бактерий (средние геометрические значения флуоресценции WGA-647 увеличились с 8,0 до 22,9 и с 250,0 до 351,0 для B. subtilis ATCC 23857 и E. faecalis Jh3.2, соответственно), но также привело к увеличению окрашивания грамотрицательных бактерий, для которых средние геометрические значения флуоресценции WGA-647 увеличились с 1,0 до 1,5 (рис. 1C). Для остальных экспериментов использовали концентрацию 20 мкг / мл.

Комбинация Van-Bodipy / Van и WGA-647 с добавкой KCl Лучше дифференцировать грамположительные от грамотрицательных бактерий

Из-за слабого окрашивания B. subtilis различение грамположительных и грамотрицательных бактерий не было оптимальным.Комбинация обоих красителей, Van-Bodipy / Van и WGA-647, поэтому была исследована, и неокрашенные события представлены на Фигуре 2A. Было получено лучшее различение, но для B. subtilis сигнал флуоресценции все еще был близок к тому, который наблюдался для грамотрицательных бактерий (рис. 2В). Как описано Holm and Jespersen (2003), добавление 1 M KCl улучшило эффективность окрашивания, что привело к четкому различию между B. subtilis и грамотрицательными бактериями.Как окрашивание Van-Bodipy / Van, так и WGA-647 были улучшены для B. subtilis в присутствии 1 M KCl с увеличением среднего геометрического значения флуоресценции Van-Bodipy / Van и WGA-647 с 3,3. и от 9,7 до 11,7 и 93,3 соответственно (рис. 2C). Небольшое усиление окрашивания WGA-647 также наблюдалось для грамотрицательных бактерий, но разница оставалась значительной по сравнению с грамположительными бактериями.

Рисунок 2. Оптимизация различения грамположительных и грамотрицательных бактерий с добавлением KCl.Ночная культура тестируемых бактерий была доведена до OD ₆₀₀ 0,5. (A) Представлены неокрашенные виды бактерий. Окрашивание проводили комбинацией Van-Bodipy / Van / WGA-647 либо в присутствии (B), PBS, либо (C) 1 M KCl в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Грамположительные бактерии B. subtilis ATCC 23857, E. faecalis ATCC 29212, L. lactis ATCC 11454 представлены красным, оранжевым и розовым цветом соответственно, а грамотрицательные бактерии K.pneumoniae ATCC 700603, S. enterica typhimurium ATCC 13311 и E. coli ATCC 35218 выделены зеленым, голубым и синим цветом соответственно. Каждый вид бактерий окрашивали отдельно и объединяли на одном участке FCM.

Методы фиксации PFA и этанола по-разному влияют на оптимизированный метод окрашивания

Чтобы определить, можно ли использовать метод окрашивания по Граму после фиксации образца, были исследованы два метода: 1% PFA и 95% этанол в течение 1 часа.Неокрашенные события и события, окрашенные в присутствии 1 M KCl, представлены на фигурах 3A, B, соответственно. Фиксация PFA не сильно повлияла на эффективность окрашивания тестируемых грамположительных бактерий (рис. 3C). Средние геометрические значения флуоресценции Van-Bodipy / Van незначительно снизились с 62,3 до 41,7 и с 428,0 до 371,0 для B. subtilis и L. lactis соответственно, а средние геометрические значения флуоресценции WGA-647 снизились с 126,0 до 77,4 и с 455,0 до 320,0 для Б.subtilis и L. lactis соответственно. Эти вариации не изменили различия между грамположительными и грамотрицательными бактериями. Было отмечено небольшое увеличение окрашивания грамотрицательных бактерий, для которых средние геометрические значения флуоресценции Ван-Бодипи / Ван увеличились с 1,3, 1,1 и 2,1 до 1,6, 1,9 и 3,3 для E. coli , K. pneumoniae и S. enterica typhimurium соответственно. В отличие от PFA, фиксация 95% этанолом приводила к изменениям окрашивания, в основном для грамотрицательных бактерий, для которых средние геометрические значения флуоресценции Ван-Бодипи / Ван увеличились примерно с 1.2 для всех грамотрицательных бактерий до около 17,0 для S. enterica typhimurium и K. pneumoniae и около 22,0 для E. coli после фиксации этанолом (рис. 3D). Различие между грамположительными и грамотрицательными бактериями сохранилось, но этот метод фиксации следует использовать с осторожностью, поскольку он может привести к неправильной интерпретации в сочетании с окрашиванием Ван-Бодипи / Ван / WGA-647.

Рисунок 3. Влияние методов фиксации PFA и этанола на окрашивание по Граму.Ночная культура тестируемых бактерий была доведена до OD ₆₀₀ 0,5. (A) Представлены неокрашенные виды бактерий. Бактерии окрашивали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин комбинацией Van-Bodipy / Van / WGA-647 в присутствии 1 М KCl перед фиксацией (B) или через 1 ч фиксации 1% PFA ( C) или 95% этанол (D) . Грамположительные бактерии B. subtilis ATCC 23857, E. faecalis ATCC 29212, L.lactis ATCC 11454 представлены красным, оранжевым и розовым цветом соответственно, а грамотрицательные бактерии K. pneumoniae ATCC 700603, S. enterica typhimurium ATCC 13311 и E. coli ATCC 35218 показаны зеленым светом. синий и синий соответственно. Каждый вид бактерий окрашивали отдельно и объединяли на одном участке FCM.

Различные штаммы одного вида окрашиваются по-разному WGA-647

Метод окрашивания, сочетающий Van-Bodipy / Van / WGA-647, был сначала проверен с использованием 40 аэробных / факультативных анаэробных штаммов, принадлежащих к B.subtilis , E. faecalis , L. lactis , Staphylococcus aureus , E. coli , K. pneumoniae и S. enterica видов. Окрашивание Ван-Бодипи / Ван было одинаковым для всех протестированных штаммов, принадлежащих к одному виду (рис. 4). Грамотрицательные бактерии не окрашивались или окрашивались незначительно по сравнению с грамположительными бактериями. Средние геометрические значения флуоресценции Van-Bodipy / Van и WGA не превышали 4,0 и 2,5 соответственно для всех протестированных грамотрицательных штаммов.Штаммы B. subtilis были наиболее слабо окрашенными среди грамположительных бактерий со средними геометрическими значениями флуоресценции Ван-Бодипи / Ван в диапазоне от 18,0 до 70,0 в зависимости от штамма. Для E. faecalis , S. aureus и L. lactis средние геометрические значения флуоресценции Ван-Бодипи / Ван составили около 366,0, 1463,0 и 183,0 соответственно. В отличие от окрашивания по Ван-Бодипи / Ван, штаммы по-разному реагировали на окрашивание WGA-647. Значительная изменчивость наблюдалась в пределах E.faecalis , для которых средние геометрические значения флуоресценции WGA-647 варьировались от 5,0 до 400,0, тогда как небольшие изменения наблюдались для S. aureus (от 260,0 до 600,0 со средним значением около 389,0), L. lactis (от 40,0 до 240,0) и B. subtilis (от 29,0 до 100,0). Таким образом, с помощью этого окрашивания грамположительные бактерии можно было легко отличить от грамотрицательных бактерий.

Рис. 4. Анализ проточной цитометрии с окрашиванием по Граму аэробных / факультативных анаэробных штаммов.Ночные культуры тестируемых бактериальных штаммов доводили до OD ₆₀₀ 0,5. Окрашивание проводили определенной комбинацией Van-Bodipy / Van / WGA-647 при их оптимальных концентрациях 2/2/20 мкг / мл в 1 M KCl в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Каждый штамм окрашивали отдельно и объединяли на одном графике FCM. Окрашивание проводили в трех биологических повторностях, но на этом рисунке представлен только один из трех повторностей.

Тестирование метода окрашивания по Граму на нескольких строго анаэробных комменсальных штаммах

Чтобы определить, можно ли использовать комбинацию Van-Bodipy / Van / WGA-647 для строго анаэробных комменсальных штаммов, окрашивание оценивали с использованием выбора представляющих интерес видов.Окрашивание проводили в трех биологических повторах для каждого штамма (рис. 5). Верхний, средний и нижний ряды соответствуют видам бактерий, которые обычно описываются как грамположительные, грамотрицательные и грамотрицательные бактерии соответственно. Ожидается, что они будут окрашены (Gram +) и неокрашены (Gram-) при окрашивании Van-Bodipy / Van / WGA-647. Разработанное окрашивание Van-Bodipy / Van / WGA-647 позволило идентифицировать тестируемые виды как грамположительные бактерии, за исключением Clostridium scindens DSM 5676 (рис. 5B), который был лишь слегка окрашен Van-Bodipy / Van (средние геометрические значения флуоресценция 12.9 ± 1,0) и почти не окрашиваются WGA-647 (средние геометрические значения флуоресценции 1,6 ± 0,1), что затрудняет дифференциацию от грамотрицательных бактерий. Гетерогенное окрашивание наблюдалось для Eubacterium hallii DSM 17630 (рис. 5А). Отдельно от окрашивания Van-Bodipy / Van / WGA-647, окрашивание Live / Dead выполняли на той же культуре. Это позволило сопоставить популяцию, окрашенную Van-Bodipy / Van / WGA-647, которая была связана с «жизнеспособной» фракцией E.Hallii DSM 17630 культура. Аналогичный эффект произошел с E. hallii DSM 3353, и оценка в разные моменты времени выявила вариации окрашивания в зависимости от времени культивирования (дополнительный рисунок S2). Все флуоресцентное окрашивание соответствовало окрашиванию кристаллическим фиолетовым / сафранином, причем окрашивание более темным фиолетовым было получено как для штаммов E. hallii (фиг. 5A и дополнительный рисунок S2), так и [ Ruminococcus ] крутящих моментов PCK 18 (фиг. 5C) по сравнению с C.scindens (Рисунок 5B). Среди описанных грамположительных бактерий Subdoligranulum variabile можно классифицировать как грамположительные бактерии на основании окрашивания (рис. 5L). Флуоресценция на длине волны излучения Ван-Бодипи соответствовала автофлуоресценции штамма, для которого среднее геометрическое значение составляло 11,3 ± 0,1. Флуоресценция не сильно увеличивалась при окрашивании по Ван-Бодипи / Вану со средним геометрическим значением 17,8 ± 0,5. На длине волны излучения WGA-647 автофлуоресценции не наблюдалось.И R.instinalis (Рисунок 5J), и Flavonifractor plautii PCK 48 (Рисунок 5K) были слегка окрашены по Ван-Бодипи / Вану (средние геометрические значения флуоресценции 10,5 ± 1,2 и 10,7 ± 1,1 соответственно) и WGA- 647 (среднегеометрические значения флуоресценции 9,1 ± 1,6 и 3,5 ± 0,4 соответственно). Все протестированные грамотрицательные бактерии не окрашивались. Единственным исключением был Prevotella copri , окрашивание не позволило идентифицировать его как грамотрицательную бактерию, поскольку наблюдалась флуоресценция на длине волны излучения Ван-Бодипи, достигая среднего геометрического значения 12.5 ± 1,7 (данные не представлены).

Рис. 5. Ван-Бодипи / Ван / WGA-647 и окрашивание по Граму кристаллическим фиолетовым грамположительных, грамотрицательных и грамотрицательных строго анаэробных бактерий. Верхний ряд соответствует культурам видов бактерий, описанных как грамположительные, включая (A) E. hallii DSM 17630, (B) C. scindens DSM 5676 (C) [ Ruminococcus ] крутящие моменты PCK 18 и (D) [ Clostridium ] spiroforme PCK 31.Средний ряд соответствует видам бактерий, описанных как грамотрицательные, включая (E) Akkermansia muciniphila DSM 22959, (F) Alistipes finegoldii DSM 17242, (G) Christensenella minuta DSM (H) Bacteroides fragilis DSM 2151 и (I) Bacteroides thetaiotaomicron DSM 2079. Нижний ряд соответствует видам бактерий, описанным как грамм-переменная, включая (J) R.кишечник DSM 14610, (K) Flavonifractor plautii PCK 48 и (L) S. variabile DSM 15176. Все культуры были скорректированы в диапазоне от 10 ⁵ до 10 ⁷ событий / мл на основе количественной оценки проточной цитометрии. Окрашивание проводили определенной комбинацией Van-Bodipy / Van / WGA-647 при их оптимальных концентрациях 2/2/20 мкг / мл в 1 M KCl в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Окрашивание проводили в трех биологических повторах, и каждый из них объединяли на одном участке FCM.Параллельно те же культуры окрашивали кристаллическим фиолетовым и сафранином, и предметные стекла наблюдали с помощью 100-кратного масляного иммерсионного объектива. Окрашивание кристаллическим фиолетовым каждого вида бактерий представлено на соответствующих графиках FCM.

Оценка живого / мертвого окрашивания чистых культур строго анаэробных комменсальных бактерий

Для оценки эффективности окрашивания живых / мертвых бактерий и его корреляции с культивированием была проведена анаэробная сортировка и культивирование анаэробных бактерий, окрашенных Syto 9 и PI, для нескольких представляющих интерес видов.Жизнеспособность культур сильно различалась в зависимости от рассматриваемых штаммов (дополнительный рисунок S3). Доля «жизнеспособных» бактерий снизилась до 40% через 2 дня культивирования для штаммов C. scindens и E. hallii , тогда как для R. ). Для B. fragilis , B. thetaiotaomicron и P. copri культуры быстро достигли доли «жизнеспособных» бактерий менее 20% через 2 дня (дополнительный рисунок S3).От четырех до более чем 7 дней требовалось наблюдать значительную смертность для других грамотрицательных видов, за исключением C. minuta , для которого примерно 95% бактерий все еще были помечены как «жизнеспособные» после 10 дней культивирования (дополнительный рисунок S3). . На основании этих жизнеспособностей P. copri , оба штамма E. hallii , B. thetaiotaomicron и B. fragilis были собраны через 24 часа культивирования; C. scindens и R. Кишечник между 24 и 48 часами и A.muciniphila , C. minuta , A. finegoldii и S. variabile через 5–7 дней культивирования. Эксперимент по сортировке проводили в трех биологических повторах для каждого штамма. Процент восстановления после сортировки был рассчитан для каждой отсортированной «жизнеспособной» — и «нежизнеспособной» окрашенной фракции на основании роста, наблюдаемого на культуральных чашках (фиг. 6A). Процент бактерий, культивируемых из «жизнеспособной» фракции, превышал 10% для всех видов, начиная с 12% для R.кишечник до 78% для C. minuta . Единственным исключением был для S. variabile , для которого менее 10% бактерий, отсортированных и культивированных из «жизнеспособной» фракции, позволяли расти колониям. Несколько колоний все еще культивировали из «нежизнеспособной» фракции, что соответствует примерно 0,1–3% отсортированных бактерий. Единственное исключение составил C. scindens , для которого ок. Были культивированы 10% бактерий, отсортированных из «нежизнеспособной» фракции (рис. 6В).

Рис. 6. Культивирование «жизнеспособных» — и «нежизнеспособных» окрашенных фракций. Культуры строго анаэробных бактерий, скорректированные в диапазоне от 10 ⁷ до 10 ⁸ событий / мл на основе количественной оценки проточной цитометрии, окрашивали Syto 9 и PI и затем сортировали на планшетах с mGAM. (A) Пример анаэробной сортировки «жизнеспособных» и «нежизнеспособных» окрашенных фракций A. muciniphila и C. minuta . (B) Процент восстановления после сортировки «жизнеспособных» и «нежизнеспособных» окрашенных фракций на основе окрашивания Live / Dead.Процент восстановления был рассчитан путем сообщения количества наблюдаемых колоний по сравнению с количеством ожидаемых отсортированных событий. Эксперименты по сортировке проводили по крайней мере в трех биологических повторностях. (C) Изображение ворот, используемых для сортировки различных строго анаэробных видов бактерий.

Эксперимент ферментации

Чтобы определить, можно ли использовать метод окрашивания для отслеживания эволюции сложных экосистем во время процессов ферментации, этот метод был оценен на образцах, полученных в результате периодической ферментации различных образцов фекалий, выполненных в различных условиях культивирования.Три образца кала F1, F2 и F3 культивировали в микробиореакторе Micro-24 ^® в культуральной среде mGAM с pH, регулируемым на уровне 6,2 или 6,5. Концентрация растворенного кислорода поддерживалась на уровне 0,01% во всей кассете во время ферментации. В наших экспериментах было трудно регулировать pH, с постоянным увеличением до 6,8 (F1 и F3) до 6,9 (F2) после 72 часов ферментации для условий pH 6,5 и от 6,4 (F1 и F3) до 6,5 (F2). для pH 6.2 (дополнительный рисунок S4).

Проточная цитометрия как первый уровень анализа сложных экосистем

Состав культивируемой фекальной микробиоты F1, F2 и F3 был проанализирован с помощью проточной цитометрии, которая позволила измерить количество бактерий и соотношение событий, окрашенных PI / Syto 9, что приблизительно соответствует общей жизнеспособности. Также оценивались грамположительные и грамотрицательные доли. После 24 часов ферментации жизнеспособность различных культивируемых материалов существенно не различалась, составляя около 70–85% для трех образцов фекалий, независимо от исходного состояния pH.Однако впоследствии потеря жизнеспособности была больше, особенно в условиях pH 6,5, когда через 72 часа ферментации наблюдалась менее 40% жизнеспособности (рис. 7).

Рис. 7. Изменение оценочной жизнеспособности во время ферментации. Жизнеспособность культивированных образцов фекалий измеряли с помощью проточной цитометрии в течение 72 часов ферментации. В каждый момент взятия проб все образцы окрашивали Syto9 и PI. После 15 мин инкубации в темноте при комнатной температуре образцы анализировали методом проточной цитометрии и рассчитывали жизнеспособность для (A), F1, (B), F2 и (C), F3.

Бактериальная биомасса, измеренная с помощью количественного определения бактерий FCM, была обогащена на 1,9–2,2 логарифмических единиц в культурах объемом 5 мл по сравнению с исходными образцами фекалий после 48 часов ферментации. Окрашивание по Граму с помощью Van-Bodipy / Van / WGA-647 также выполняли непосредственно после отбора проб для отслеживания ферментации с точки зрения обогащения экосистем. После 24 ч ферментации точечные диаграммы FSC / SSC неокрашенных культур не показали различий между троекратными повторами для данной регуляции pH, но выявили четкую разницу между культурами при pH 6.2 и 6.5 для двух образцов кала F1 и F3 (дополнительные рисунки S5A, S7A). Большее количество групп было идентифицировано в культурах с pH 6,2, которые, как правило, оставались более похожими на их соответствующие исходные уровни по сравнению с культурами с pH 6,5. Окрашивание Van-Bodipy / Van / WGA-647 подтвердило различия, наблюдаемые между культурами с pH 6,2 и 6,5 для F1 и F3, с большим количеством групп, положительно окрашенных WGA-647, 1 и 2 группы, соответственно, в культурах с pH 6,2. по сравнению с культурами с pH 6,5 только с одной или отсутствующей группами, положительно окрашенными WGA-647 (дополнительные рисунки S5B, S7B).Разница была менее заметна для образца фекалий F2 на графиках FSC / SSC и Van-Bodipy / Van / WGA-647 (дополнительные рисунки S6A, S6B). В результате неокрашенные объекты были более представлены в культурах с pH 6,5 через 24 часа ферментации с пропорциями 68,5 ± 0,6% против 35 ± 1,9%, 63,7 ± 2,4% против 52,5 ± 1,2% и 81 ± 1,6% против 28,7 ± 1,4% для F1, F2 и F3 соответственно. Бактериальные сообщества не сильно изменились между 24 и 48 часами ферментации (дополнительные рисунки S5C, D, S6C, D, S7C, D).

Регулирование pH регулирует культивирование фекальной микробиоты во время периодической ферментации

Затем образцы анализировали на основе секвенирования гена 16S рРНК и сравнивали с соответствующими исходными уровнями. На уровне филумов и семей более низкая регуляция pH позволила лучше сохранить исходный состав фекальной микробиоты. Четыре доминирующих типа микробиоты кишечника: Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria и Proteobacteria были представлены во всех культурах. Однако наблюдалась резкая амплификация Proteobacteria, при этом относительное количество связанных с Proteobacteria OTU достигало 20–30% и 40–60% после 48 часов культивирования при pH 6.2 и pH 6,5 соответственно (рисунок 8 и дополнительная таблица S2). После 24 часов ферментации и независимо от образца фекалий Clostridiaceae 1 стали основным семейством типа Firmicutes, достигнув относительной численности около 60% (F1) и 50% (F3, F2) среди культур Firmicutes для культур с pH 6,5 ( Рисунок 8 и дополнительная таблица S2). В результате количество Lachnospiraceae и Ruminococcaceae , изначально доминировавших, было значительно снижено в этих культурах, достигнув менее 1% от Firmicutes.Семейства Lachnospiraceae и Ruminococcaceae лучше сохранялись в культурах с pH 6,2, но со значительным снижением их относительной численности по сравнению с исходными уровнями (Рисунок 8 и дополнительная таблица S2). Семейства типа Bacteroidetes относительно хорошо сохранились, за исключением семейства Prevotellaceae для F2, численность которого резко снизилась независимо от регулирования pH. Семейство Enterobacteriaceae доминировало над типом Proteobacteria и было примерно вдвое ниже по pH 6.2 культуры по сравнению с культурами с pH 6,5 (Рисунок 8 и дополнительная таблица S2).

Рис. 8. Относительная численность представлена ​​на уровне семейства образцов фекалий F1, F2 и F3 после 24 и 48 часов ферментации, связанной с их цитометрическим анализом. Анализ проточной цитометрии представлен для ферментации (A) F1, (B) ферментации F2 и (C) ферментации F3. (D) Представлены результаты секвенирования гена 16S рРНК, представлены только семьи с относительной численностью более 1% на исходном уровне или после ферментации.Данные представлены как среднее + стандартное отклонение для трех повторов, за исключением исходных значений.

Мы также рассмотрели α- и β-разнообразие культивируемых образцов на уровне OTU. Более низкая регуляция pH привела к богатству, аналогичному исходному, за исключением F3 (рис. 9A). Богатство даже превзошло базовые уровни после 48 часов брожения. Индексы Шеннона и Обратного Симпсона показали меньшее разнообразие культур по сравнению с исходными образцами фекалий, за исключением F2 в культурах с pH 6,2 после 24 часов ферментации (Фигуры 9B, C).В целом альфа-разнообразие было стабильным с течением времени.

Рис. 9. Полученные индексы α-разнообразия на уровне OTU (A) Богатство (B) Индекс Шеннона (C) Обратный индекс Симпсона на основе секвенирования гена 16S рРНК.

Несмотря на то, что количество различных таксонов в культивируемых образцах фекалий в основном было сходным с их исходным уровнем, относительную численность не удалось сохранить, и культивируемые образцы фекалий показали несходство с их соответствующим исходным уровнем (дополнительный рисунок S8A).Большее сходство с исходными значениями, измеренное с помощью индекса Брея-Кертиса на уровне рода, было получено в культурах с pH 6,2 независимо от исходного образца фекалий, около 30% для F1 и F3 и более 40% для F2 (дополнительный рисунок S8B). Сходство было относительно стабильным с течением времени.

Сравнение пропорций грамположительных и грамотрицательных бактерий, измеренных с помощью FCM, с пропорциями, оцененными на основе секвенирования репертуара 16S рРНК

Доли

грамположительных и грамотрицательных бактерий, измеренные с помощью FCM, сравнивали с пропорциями, рассчитанными с помощью анализа репертуара 16S рРНК с использованием двух разных методов.Значения R ² , рассчитанные для кривых линейной регрессии, представлены на фиг. 10. Эти значения составляют 0,25 и 0,26, когда грамположительные и грамотрицательные пропорции, измеренные цитометрией, сравниваются с пропорциями, выведенными из классического анализа 16S рРНК. Они достигают 0,42 (грамотрицательный) и 0,90 (грамположительный), когда пропорции, измеренные при проточной цитометрии, сравниваются с пропорциями, выведенными из данных 16S рРНК после коррекции, основанной на количестве копий гена 16S рРНК и количестве клеток в образце (методы 2 .12; Vandeputte et al., 2017).

Рисунок 10. Корреляция пропорций грамположительных и грамотрицательных бактерий, оцененная с помощью секвенирования репертуара 16S рРНК и проточной цитометрии. Доли грамположительных и грамотрицательных бактерий, оцененные с помощью секвенирования гена 16S рРНК с использованием метода относительного или количественного профилирования микробиома (R- или QMP), сравнивали с пропорциями проточной цитометрии, оцененными методом окрашивания Van-Bodipy / Van / WGA-647. Были получены кривые линейной регрессии и рассчитаны значения R ² : (A) корреляция между RMP грамотрицательных бактерий и RMP.FCM, (B) корреляция грамположительных бактерий RMP против FCM, (C) корреляция грамотрицательных бактерий QMP против FCM и (D) корреляция грамположительных бактерий QMP против FCM.

Обсуждение

Изолированные штаммы, а также более или менее сложные смеси комменсальных штаммов все чаще исследуются в качестве возможных методов лечения большого количества патологий как у людей, так и у животных. Поэтому становится необходимым разработать инструменты, позволяющие отслеживать эволюцию этих экосистем, будь то в контексте НИОКР, направленных на изучение влияния различных параметров на эволюцию культурных популяций, или в промышленном контексте, чтобы контролировать производство интересующих штаммов.Технологии высокопроизводительного секвенирования предлагают высокий уровень точности для изучения филогенетического состава микробных популяций, но страдают определенными ограничениями: отсутствие измерения жизнеспособности бактерий, измерение относительной, а не абсолютной численности популяций, но, прежде всего, все еще относительно высокой стоимость и значительные задержки в получении результатов секвенирования.

В этом контексте FCM, адаптированный для бактериальных клеток, представляет собой интересную, быструю и экономичную технологию для быстрой оценки динамики сложных микробных экосистем и общей жизнеспособности их составляющих.По сравнению с анализом эукариотических клеток, анализ бактериальных клеток с использованием FCM все еще ограничен относительно небольшим количеством доступных флуоресцентных красителей. В основном используются красители нуклеиновых кислот, а также лектины, меченые антибиотики или специфические красители, позволяющие оценить мембранный потенциал или метаболическую активность (Muller and Nebe-von-Caron, 2010). В этом исследовании мы предложили оценить использование классического метода окрашивания Live / Dead, а также комбинации меченых WGA и ванкомицина в качестве внешних структурных красителей для идентификации и дифференциации грамположительных бактерий от грамотрицательных в сложных экосистемах.Оба метода окрашивания сначала оценивались на серии изолированных штаммов, включая строгие анаэробы, а затем использовались для отслеживания эволюции сложной микробиоты в процессе ферментации.

Было определено, что использование 4 мкг / мл Van-Bodipy / Van в сочетании с 20 мкг / мл WGA-647 в 1 М KCl является оптимальным условием окрашивания для различения грамположительных бактерий от грамотрицательных. Как описано ранее, добавление 1 M KCl улучшало окрашивание некоторых грамположительных бактерий как WGA-647, так и Van-Bodipy / Van (Holm and Jespersen, 2003).KCl может дестабилизировать внешние структуры, в том числе тейхоевые кислоты, которые обычно жесткие в воде и меняют конфигурацию катушки на случайную в присутствии соли (Doyle et al., 1974), что приводит к большей доступности структур, признанных Ван -Бодипы / Ван и WGA-647. Фиксация 1% PFA может быть использована для отсрочки анализа образцов, поскольку отличия грамположительных бактерий от грамотрицательных бактерий не изменились. И наоборот, этанол мог вызвать растворение мембранных липидов, что привело к модификации третичных структур белков (Hobro and Smith, 2017) и разоблачению концевых цепей D-Ala-D-Ala пептидогликана, которые ранее были недоступны, что привело к усиленное окрашивание грамотрицательных бактерий.Скрининг окрашивания Van-Bodipy / Van / WGA-647 был эффективным для различения различных грамположительных видов или даже штаммов бактерий, как это наблюдалось для E. faecalis . Бактерии, принадлежащие к этому виду, демонстрируют капсульные полисахариды (Hancock and Gilmore, 2002), определяющие различные серотипы на основе их разнообразия (Hufnagel et al., 2004; Thurlow et al., 2009). Будучи по-разному экспрессируемыми среди штаммов E. faecalis , такие капсулы могут маскировать структуры узнавания WGA и предотвращать его связывание с пептидогликаном.Лишь слабое окрашивание как Van-Bodipy / Van, так и WGA-647 наблюдалось для комменсальных анаэробных видов R. Кишечник , F. plautii (PCK48) и C. scindens . Это не было полностью неожиданным для F. plautii и R. Кишечник , которые первоначально были описаны как виды с грамм-переменной (Duncan, 2002; Carlier et al., 2010). C. scindens описан как грамположительный вид, но он обладает способностью образовывать споры, что может влиять на эффективность окрашивания.Окрашивание Van-Bodipy / Van / WGA-647 S. variabile , классифицирующее его как грамположительную бактерию, не согласуется с литературой, в которой S. variabile описывается как грамотрицательная окрашенная бактерия. Однако окрашивание коммерческим набором LIVE BacLight ^TM Bacterial Gram Stain Kit (Thermofisher), сочетающим Syto 9 и HI, последний предпочтительно маркирует грамположительные бактерии, также окрашивало S. variabile как грамположительные бактерии (дополнительный рисунок). S9).Окрашивание HI подтверждает классификацию S. variabile как монодермы Firmicutes (Megrian et al., 2020). Кроме того, штамм был чувствителен к ванкомицину с минимальной ингибирующей концентрацией 4 мг / л и содержит в своем геноме консервативные последовательности, кодирующие поверхностные белки мотивов лейцин-пролин-х-треонин-глицин (LPxTG), закрепленные на пептидогликане (ссылка последовательности WP_147644604.1 и WP_007048259.1) в грамположительных бактериях, что усиливает предыдущие результаты.Наконец, в наших экспериментах окрашивание Van-Bodipy / Van / WGA-647 было оптимизировано с использованием культуры, собранной в конце фазы логарифмического роста. Было бы интересно посмотреть на возможные варианты окрашивания в зависимости от стадии роста чистых бактериальных культур (Beveridge, 1990).

Окрашивание Live / Dead ^® BacLight ^TM уже использовалось другими для оценки соотношения «жизнеспособных» и «нежизнеспособных» бактерий в фекальной микробиоте с использованием проточной цитометрии с относительно хорошим соответствием между культивируемостью и FCM. результаты, когда образцы защищены от воздействия кислорода (Bellali et al., 2019; Burz et al., 2019). Однако также сообщалось, что окрашивание PI, включенное в набор, может вводить в заблуждение для конкретных видов бактерий, особенно когда бактерии собираются во время раннего экспоненциального роста и имеют высокий мембранный потенциал (Shi et al., 2007; Kirchhoff and Cypionka, 2017). Из-за этих ограничений мы были заинтересованы в оценке культивирования фракций, определенных как «жизнеспособные» или «нежизнеспособные» с помощью набора для окрашивания Live / Dead ^® BacLight ^TM для нескольких строго анаэробных видов, представляющих интерес.В нашем исследовании наблюдалось до четырех популяций с разными уровнями окрашивания Syto 9 и PI в зависимости от тестируемых анаэробных видов (рис. 6C). Эти результаты не удивительны, поскольку промежуточные состояния, характеризующиеся разными уровнями окрашивания клеток Syto 9 и PI, уже были описаны другими (Berney et al., 2007). Анаэробная сортировка «жизнеспособных» фракций позволила культивировать более 10% отсортированных событий. Единственное исключение было для S. variabile , для которого автофлуоресценция в длине волны излучения Syto 9 могла, возможно, смещать анализ.Вводящие в заблуждение результаты были также получены для C. scindens , для которого наблюдался значительный рост отсортированной фракции, идентифицированной как «нежизнеспособная». C. scindens показал необычный образец окрашивания со слабым Syto 9 и слабым окрашиванием PI (фиг. 6C). Способность C. scindens образовывать споры, возможно, может быть причиной этих паттернов окрашивания, поскольку доступ к бактериальной ДНК затруднен из-за покрытия спор (Magge et al., 2009). Стоит отметить, что ИП потенциально может быть токсичным для бактерий и мог повлиять на результаты, полученные для отсортированных событий, окрашенных ИП.Поэтому при применении к сложным экосистемам следует с осторожностью подходить к анализу жизнеспособности, поскольку они представлены широким спектром видов бактерий, которые потенциально могут по-разному реагировать на окрашивание PI.

О резком увеличении количества протеобактерий во время экспериментов по периодической ферментации уже сообщалось другими (Takagi et al., 2016; Sasaki et al., 2017; O’Donnell et al., 2018; Wiese et al., 2018). Более высокая относительная численность Proteobacteria была получена после 24 часов ферментации в нашем исследовании по сравнению с экспериментами по периодической ферментации, проведенными с той же культуральной средой mGAM и в тех же условиях pH (Takagi et al., 2016). Более важная амплификация Escherichia , наблюдаемая при pH 6,5 по сравнению с культурами pH 6,2, согласуется с исследованием Ilhan et al. (2017), которые показали преобладание этого рода в культурах, начинающихся при pH 6,5 и 6,9. Быстрорастущие, факультативные анаэробные виды бактерий, принадлежащие к этому роду, могут легко получить преимущество перед медленнорастущими облигатными анаэробами на начальных этапах ферментации, что может объяснить быстрое расширение изначально малочисленной популяции.Регулирование pH было ключевым фактором, влияющим на восстановление семейств и родов бактерий, которые всегда лучше сохранялись в условиях культивирования с pH, регулируемым на уровне 6,2, что согласуется с исследованием Walker et al. (2005), в которых лучшая сохранность представляющих интерес родов была получена при pH, регулируемом на уровне 5,5 по сравнению с 6,7. Три образца фекалий, использованные в эксперименте, эволюционировали по-разному во время ферментации, что привело к различиям в культивируемых семьях или родах. Влияние исходного сложного микробного сообщества было ранее продемонстрировано на культурах периодической ферментации (Perrotta et al., 2017; Van den Abbeele et al., 2018). Ферментация привела к различиям между культивируемыми образцами и исходными уровнями, явление, которое ранее наблюдалось в сопоставимой 24-луночной ферментационной системе in vitro (O’Donnell et al., 2018).

Оптимизированный метод окрашивания Van-Bodipy / Van / WGA-647 представляет собой первый уровень анализа сложных микробных экосистем, полученных при ферментации in vitro . Этот метод окрашивания выявил сильное сходство между популяционными сообществами, полученными для трех повторностей, а также резкое влияние условий pH на культуру бактериальных сообществ, что было дополнительно подтверждено секвенированием гена 16S рРНК (дополнительные рисунки S5, S6 и S7).В предыдущем исследовании FCM использовался для количественного пересчета относительной численности, полученной секвенированием гена 16S рРНК на основе количества бактерий (Vandeputte et al., 2017). Вместо того, чтобы уменьшать выходные данные до равного количества считываний для каждого образца, Vandeputte et al. (2017) преобразовали данные об относительной численности секвенирования в количественные профили микробиома, используя подсчет клеток в образцах. Интересно, что мы получили лучшие значения корреляции с измерениями FCM, когда этот подход, а не классический подход относительной численности, использовался для оценки долей в граммах на основе присвоения OTU Gram.Особенно это касалось грамположительных бактерий. Это наблюдение должно быть смягчено тем фактом, что эти анализы остаются потенциально сильно предвзятыми. Как наблюдается на чистых культурах, иногда трудно определить статус по Граму для конкретных видов / штаммов бактерий, и рискованно присвоить статус по Граму OTU, потенциально соответствующей нескольким видам, некоторые из которых никогда не культивировались и чей статус по Граму поэтому не известно. Значение числа оперонов 16S рРНК, используемых в качестве корректирующего фактора в подходе количественного профилирования микробиома, также очень подвержено систематическим ошибкам, поскольку это значение неизвестно для многих видов и может также варьироваться между штаммами (Louca et al., 2018). В этом контексте интересным анализом может быть сортировка подсообществ в соответствии с их статусом по Граму, измеренным с использованием FCM, а затем репертуара гена 16S рРНК последовательности отсортированных фракций, что планируется в будущих экспериментах.

Заключение

В нашем исследовании описан быстрый и экономичный инструмент на основе FCM с использованием меченых WGA и ванкомицина, который можно использовать для быстрого создания моделей составных популяционных сообществ сложных микробных экосистем, полученных с помощью ферментаций in vitro .Это потенциально полезно в качестве экономичного инструмента, позволяющего отслеживать изменения во время процессов ферментации с целью выбора образцов, которые следует далее анализировать с помощью секвенирования. Эта комбинация окрашивания позволила дать общие тенденции эволюции данного образца. Мы также заметили, что набор жизнеспособности Live / Dead ^® BacLight ^TM был надежным инструментом для оценки жизнеспособности строго анаэробных комменсальных видов, испытанных в нашем исследовании, за заметным исключением двух видов, для которых автофлюоресценция и споруляция могут предвзятые результаты анализа.Эти предубеждения следует учитывать при анализе сложных микробных сообществ. В будущем FCM, используемый в сочетании с окрашиванием Van-Bodipy / Van / WGA-647, может стать первым аналитическим инструментом для оценки экосистем высокого уровня сложности, включая образцы комменсалов и окружающей среды. Метод окрашивания, вероятно, был бы улучшен, если бы его использовали в сочетании с другим окрашиванием, таким как ДНК-интеркалирующий краситель DAPI, который, как было показано, выявляет гетерогенность и динамические изменения кишечной микробиоты (Zimmermann et al., 2016), но требует использования УФ-лазера. FCM также может использоваться для квалификации пробиотиков одного штамма или сложных смесей бактерий, полученных в результате промышленной ферментации. Наконец, можно предположить, что FCM, вероятно, будет полезен для отслеживания эволюции четко определенной микробиоты в доклинических моделях животных, таких как модели гнотобиотических мышей (Brugiroux et al., 2016).

Заявление о доступности данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, можно найти в SRA / PRJNA609248 / https: // www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA609248, FlowRepository / FR-FCM-Z2H9 / https: //flowrepository.org.

Авторские взносы

AD, SB, CS, JD и VT разработали концепцию экспериментов. AD выполнила все эксперименты по окрашиванию и ферментации. SB внесла свой вклад в эксперименты по окрашиванию. CG выполнила анализ и помогла интерпретировать данные секвенирования. AD и VT написали рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Конфликт интересов

AD, CG и CS работают в компании MaaT Pharma.

Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Финансирование

Эта работа была получена за счет инвестиций BIOASTER и финансировалась программой французского правительства «Investissement d’Avenir» (грант № ANR-10-AIRT-03), а MaaT Pharma получила финансирование от Association Nationale Recherche Technologie через Convention Industrielle de Formation par la Recherche (CIFRE n ° 2016/1593).

Благодарности

Мы благодарим Шарлотту Миньон, а также Марин Анию и Мелани Нехлих за техническую помощь при настройке и отборе проб для исследований ферментации соответственно. Мы благодарим Benoît Beitz за техническую помощь при анализе данных проточной цитометрии, советы и комментарии по улучшению этой рукописи. Мы также благодарим Адриена Виллэна за его помощь в биоинформатическом анализе. Наконец, мы благодарим Яна Байера за его полезные советы по развитию проточной цитометрии и Сесиль Шовель за помощь в анализе данных.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2020.01469/full#supplementary-material

Сноски

Список литературы

Аллегретти, Дж. Р., Маллиш, Б. Х., Келли, К., и Фишер, М. (2019). Эволюция использования трансплантации фекальной микробиоты и новые терапевтические показания. Ланцет 394, 420–431.DOI: 10,1016 / s0140-6736 (19) 31266-8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Arumugam, M., Raes, J., Pelletier, E., Le Paslier, D., Yamada, T., Mende, D. R., et al. (2011). Энтеротипы микробиома кишечника человека. Природа 473, 174–180. DOI: 10.1038 / nature09944

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Беллали, С., Лагье, Дж. К., Рауль, Д., и Боу Халил, Дж. (2019). Среди живых и мертвых бактерий оптимизация сбора и обработки образцов остается важной для восстановления компонентов микробиоты кишечника. Фронт. Microbiol. 10: 1606. DOI: 10.3389 / fmicb.2019.01606

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Берни М., Хэммс Ф., Босхард Ф., Вейленманн Х. У. и Эгли Т. (2007). Оценка и интерпретация жизнеспособности бактерий с помощью набора LIVE / DEAD BacLight Kit в сочетании с проточной цитометрией. Заявл. Environ. Microbiol. 73, 3283–3290. DOI: 10.1128 / AEM.02750-06

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Brugiroux, S., Beutler, M., Pfann, C., Garzetti, D., Ruscheweyh, H.J., Ring, D., et al. (2016). Геномно-управляемый дизайн определенной микробиоты мыши, которая придает устойчивость к колонизации против Salmonella enterica серовара Typhimurium . Nat. Microbiol. 2: 16215. DOI: 10.1038 / nmicrobiol.2016.215

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Burz, S. D., Abraham, A. L., Fonseca, F., David, O., Chapron, A., Beguet-Crespel, F., et al. (2019).Руководство по обращению и хранению ex vivo образцов стула, предназначенных для трансплантации фекальной микробиоты. Sci. Реп. 9: 8897. DOI: 10.1038 / s41598-019-45173-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Buysschaert, B., Byloos, B., Leys, N., Van Houdt, R., and Boon, N. (2016). Переоценка многоцветной проточной цитометрии для оценки жизнеспособности микробов. Заявл. Microbiol. Biotechnol. 100, 9037–9051. DOI: 10.1007 / s00253-016-7837-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Карлье, Дж.П., Бедора-Фор, М., К’Уас, Г., Алаузет, К., Мори, Ф. (2010). Предложение об объединении Clostridium orbiscindens Winter et al. 1991 и Eubacterium plautii (Seguin 1928) Hofstad and Aasjord 1982, с описанием Flavonifractor plautii gen. нов., гребешок. nov. и переназначение Bacteroides capillosus на Pseudoflavonifractor capillosus gen. ноя, гребешок. ноя Внутр. J. Syst. Evol. Microbiol. 60 (Pt 3), 585–590. DOI: 10.1099 / ijs.0.016725-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chang, C.J., Lin, T. L., Tsai, Y. L., Wu, T. R., Lai, W. F., Lu, C. C., et al. (2019). Пробиотики нового поколения в лечении болезней. J. Food Drug Anal. 27, 615–622. DOI: 10.1016 / j.jfda.2018.12.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хирон, К., Томпкинс, Т.А., и Бургьер, П. (2018). Проточная цитометрия: универсальная технология для конкретной количественной оценки и оценки жизнеспособности микроорганизмов в пробиотических продуктах с множеством штаммов. J. Appl. Microbiol. 124, 572–584. DOI: 10.1111 / jam.13666

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чеховска, К., Ланниган, Дж., Ван, Л., Арчидиаконо, Дж., Эшхерст, Т. М., Барнард, Р. М. и др. (2019). Cyt-geist: текущие и будущие вызовы цитометрии: доклады семинаров конференции CYTO 2018. Cytom. А 95, 598–644. DOI: 10.1002 / cyto.a.23777

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Де Хофф, П.Л., Брилл, Л. М., и Хирш, А. М. (2009). Лектины растений: связи, которые связываются в симбиозе корней и защите растений. Мол. Genet. Геномика 282, 1–15. DOI: 10.1007 / s00438-009-0460-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дхобл, А.С., Бекал, С., Долатовски, В., Янц, К., Ламберт, К. Н., и Бхалерао, К. Д. (2016). Новый высокопроизводительный многопараметрический метод проточной цитометрии для мониторинга и быстрой характеристики динамики микробиома в анаэробных системах. Биоресурсы. Technol. 220, 566–571. DOI: 10.1016 / j.biortech.2016.08.076

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дойл, Р. Дж., МакДэннел, М. Л., Стрейпс, У. Н., Бердселл, Д. К., Янг, Ф. Э. (1974). Полиэлектролитная природа бактериальных тейхоевых кислот. J. Bacteriol. 118, 606–615. DOI: 10.1128 / jb.118.2.606-615.1974

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дункан, С. Х. (2002). Roseburia Кишечник sp.nov., новая сахаролитическая бактерия, продуцирующая бутират из фекалий человека. Внутр. J. Syst. Evol. Microbiol. 52, 1615–1620. DOI: 10.1099 / 00207713-52-5-1615

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фернандес, М. М., Иванова, К., Хойо, Дж., Перес-Рафаэль, С., Франческо, А., и Цанов, Т. (2017). Нанотрансформация ванкомицина преодолевает внутреннюю резистентность грамотрицательных бактерий. ACS Appl. Матер. Интерф. 9, 15022–15030. DOI: 10.1021 / acsami.7b00217

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гейрнарт А., Калатаюд М., Гротарт К., Лаукенс Д., Девризе С., Смагге Г. и др. (2017). Бактерии, продуцирующие бутират, добавленные in vitro к микробиоте пациентов с болезнью Крона, увеличивают продукцию бутирата и улучшают целостность кишечного эпителиального барьера. Sci. Отчет 7: 11450. DOI: 10.1038 / s41598-017-11734-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гото, А., Нара, М., Сугияма, Ю., Саканака, М., Ячи, Х., Китаката, А. и др. (2017). Использование анаэробной среды Gifu для культивирования 32 доминирующих видов кишечных микробов человека и ее оценка на основе профилей ферментации короткоцепочечных жирных кислот. Biosci. Biotechnol. Biochem. 81, 2009–2017. DOI: 10.1080 / 0

51.2017.1359486

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хэнкок, Л. Э., и Гилмор, М. С. (2002). Капсульный полисахарид Enterococcus faecalis и его связь с другими полисахаридами в клеточной стенке. Proc. Natl. Акад. Sci. США 99, 1574–1579. DOI: 10.1073 / pnas.032448299

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хобро, А. Дж., И Смит, Н. И. (2017). Оценка методов фиксации: пространственные и композиционные клеточные изменения, наблюдаемые с помощью рамановской визуализации. Vib. Spectrosc. 91, 31–45. DOI: 10.1016 / j.vibspec.2016.10.012

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Холм, К., и Джесперсен, Л. (2003). Метод проточно-цитометрического окрашивания по Граму для бактерий, ассоциированных с молоком. Заявл. Environ. Microbiol. 69, 2857–2863. DOI: 10.1128 / AEM.69.5.2857-2863.2003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hufnagel, M., Hancock, L.E., Koch, S., Theilacker, C., Gilmore, M.S, and Huebner, J. (2004). Серологическое и генетическое разнообразие капсульных полисахаридов Enterococcus faecalis . J. Clin. Microbiol. 42, 2548–2557. DOI: 10.1128 / JCM.42.6.2548-2557.2004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Яниро, Г., Maida, M., Burisch, J., Simonelli, C., Hold, G., Ventimiglia, M., et al. (2018). Эффективность различных протоколов трансплантации фекальной микробиоты для инфекции Clostridium difficile: систематический обзор и метаанализ. United Eur. Гастроэнтерол. J. 6, 1232–1244. DOI: 10.1177/2050640618780762

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ильхан, З. Э., Маркус, А. К., Канг, Д. В., Риттман, Б. Э., и Б. Краймальник-Браун, Р. (2017). pH-опосредованные микробные и метаболические взаимодействия в фекальной обогащенной культуре. м Сфера 2: e0047-17. DOI: 10.1128 / mSphere.00047-17

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кирхгоф, К., Цыпенка, Х. (2017). Ион пропидия проникает в жизнеспособные клетки с высоким мембранным потенциалом во время окрашивания живых мертвецов. J. Microbiol. Методы 142, 79–82. DOI: 10.1016 / j.mimet.2017.09.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кох, К., Гюнтер, С., Деста, А. Ф., Хюбшманн, Т., и Мюллер, С.(2013). Цитометрический дактилоскопический анализ для анализа вариаций микробной структуры внутри сообщества и определения функции субсообщества. Nat. Protoc. 8, 190–202. DOI: 10.1038 / nprot.2012.149

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Краузе, Дж. Л., Шепе, С. С., Фриц-Уоллас, К., Энгельманн, Б., Ролле-Кампчик, У., Кляйнштайбер, С. и др. (2020). После разработки сообществом SIHUMIx — новой модели кишечника in vitro для использования в биореакторах. Gut Microb. 1–14. DOI: 10.1080 / 194.2019.1702431 [Epub перед печатью].

CrossRef Полный текст | PubMed Аннотация | Google Scholar

Лука С., Добели М. и Парфри Л. В. (2018). Коррекция количества копий гена 16S рРНК в исследованиях микробиома остается нерешенной проблемой. Микробиом 6:41. DOI: 10.1186 / s40168-018-0420-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лозупоне, К.А., Стомбо, Дж. И., Гордон, Дж.И., Янссон, Дж. К., и Найт, Р. (2012). Разнообразие, стабильность и устойчивость микробиоты кишечника человека. Природа 489, 220–230. DOI: 10.1038 / природа11550

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мэгге А., Сетлоу Б., Коуэн А. Э. и Сетлоу П. (2009). Анализ связывания красителя и мембранного потенциала в спорах видов Bacillus . J. Appl. Microbiol. 106, 814–824. DOI: 10.1111 / j.1365-2672.2008.04048.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мейсон, Д.Дж., Шанмуганатан С., Мортимер Ф. К. и Гант В. А. (1998). Флуоресцентный краситель по Граму для проточной цитометрии и эпифлуоресцентной микроскопии. Заявл. Environ. Microbiol. 64, 2681–2685. DOI: 10.1128 / aem.64.7.2681-2685.1998

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мегриан, Д., Тайб, Н., Витвиновски, Дж., Белойн, К., и Грибальдо, С. (2020). Одна или две мембраны? Diderm firmicutes бросает вызов разделению грамположительных / грамотрицательных. Мол. Microbiol. 113, 659–671.DOI: 10.1111 / mmi.14469

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Mueller, S., Saunier, K., Hanisch, C., Norin, E., Alm, L., Midtvedt, T., et al. (2006). Различия в фекальной микробиоте в разных европейских исследуемых популяциях в зависимости от возраста, пола и страны: кросс-секционное исследование. Заявл. Environ. Microbiol. 72, 1027–1033. DOI: 10.1128 / AEM.72.2.1027-1033.2006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мюллер, С., и Небе-фон-Карон, Г. (2010). Функциональные одноклеточные анализы: проточная цитометрия и сортировка клеток микробных популяций и сообществ. FEMS 34, 554–587. DOI: 10.1111 / j.1574-6976.2010.00214.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Nescerecka, A., Hammes, F., and Juhna, T. (2016). Конвейер для разработки и тестирования протоколов окрашивания для проточной цитометрии, продемонстрированный с помощью окрашивания SYBR Green I и йодида пропидия. Дж.Microbiol. Методы 131, 172–180. DOI: 10.1016 / j.mimet.2016.10.022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

О’Доннелл М.М., Ри М.С., Шанахан Ф. и Росс Р.П. (2018). Использование ферментационной системы мини-биореактора в качестве воспроизводимой высокопроизводительной периодической модели ex vivo дистального отдела толстой кишки. Фронт. Microbiol. 9: 1844. DOI: 10.3389 / fmicb.2018.01844

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Перротта, А.Р., Кумарасвами, Р., Бастидас-Оянедель, Дж. Р., Алм, Э. Дж. И Родригес, Дж. (2017). Состав посевного материала определяет микробное сообщество и функцию в анаэробном последовательном реакторе периодического действия. PLoS One 12: e0171369. DOI: 10.1371 / journal.pone.0171369

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Перст, Э. И., Эль-Чахтоура, Дж., Хаммес, Ф., Сайкали, П. Э., ван Лосдрехт, М. К., и Фроувенвельдер, Дж. С. (2014). Сочетание проточной цитометрии и пиросеквенирования гена 16S рРНК: многообещающий подход к мониторингу и характеристике питьевой воды. Water Res. 63, 179–189. DOI: 10.1016 / j.watres.2014.06.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Qin, J., Li, R., Raes, J., Arumugam, M., Burgdorf, K. S., Manichanh, C., et al. (2010). Каталог микробных генов кишечника человека, созданный путем метагеномного секвенирования. Природа 464, 59–65. DOI: 10.1038 / nature08821

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кураиши, М. Н., Видлак, М., Бхала, Н., Мур, Д., Прайс, М., Шарма, Н. и др. (2017). Систематический обзор с метаанализом: эффективность трансплантации фекальной микробиоты для лечения рецидивирующей и резистентной инфекции Clostridium difficile. Aliment Pharmacol. Ther. 46, 479–493. DOI: 10.1111 / apt.14201

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ругер, М., Бенш, Г., Танглер, Р., и Райхл, У. (2012). Метод проточной цитометрии для оценки жизнеспособности Staphylococcus aureus и Burkholderia cepacia в смешанной культуре. Cytom. А 81, 1055–1066. DOI: 10.1002 / cyto.a.22219

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сасаки К., Сасаки Д., Окаи Н., Танака К., Номото Р., Фукуда И. и др. (2017). Таурин не влияет на состав, разнообразие или метаболизм микробиоты толстой кишки человека, моделируемой в системе однократной ферментации. PLoS One 12: e0180991. DOI: 10.1371 / journal.pone.0180991

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ши, Л., Гюнтер, С., Хубшманн, Т., Вик, Л.Ю., Хармс, Х., и Мюллер, С. (2007). Пределы йодида пропидия как индикатора жизнеспособности клеток экологических бактерий. Cytom. А 71, 592–598. DOI: 10.1002 / cyto.a.20402

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Штифель П., Шмидт-Эмрих С., Маниура-Вебер К. и Рен К. (2015). Критические аспекты использования тестов жизнеспособности бактериальных клеток с флуорофором SYTO9 и иодидом пропидия. BMC Microbiol. 15:36. DOI: 10.1186 / s12866-015-0376-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Стоддард С. Ф., Смит Б. Дж., Хайн Р., Роллер Б. Р. и Шмидт Т. М. (2015). rrnDB: улучшенные инструменты для интерпретации изобилия генов рРНК у бактерий и архей и новая основа для будущего развития. Nucleic Acids Res. 43, D593 – D598. DOI: 10.1093 / nar / gku1201

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Такаги Р., Сасаки, К., Сасаки, Д., Фукуда, И., Танака, К., Йошида, К., и др. (2016). Система однократной ферментации для имитации микробиоты толстой кишки человека для высокопроизводительной оценки пребиотиков. PLoS One 11: e0160533. DOI: 10.1371 / journal.pone.0160533

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Thomas, V., Rochet, V., Boureau, H., Ekstrand, C., Bulteau, S., Dore, J., et al. (2002). Молекулярная характеристика и пространственный анализ упрощенной микробиоты кишечника, демонстрирующей устойчивость к колонизации против Clostridium difficile . Microb. Ecol. Health Dis. 14, 203–210. DOI: 10.1080 / 080310002082

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Томпсон, А. В., Кроу, М. Дж., Уэди, Б., Аренс, К., Туркарслан, С., Столяр, С. и др. (2015). Метод анализа, сортировки и сохранения жизнеспособности облигатных анаэробных микроорганизмов из сложных микробных сообществ. J. Microbiol. Методы 117, 74–77. DOI: 10.1016 / j.mimet.2015.07.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Терлоу, Л.Р., Томас, В. К., и Хэнкок, Л. Е. (2009). Продукция капсульного полисахарида в Enterococcus faecalis и вклад CpsF в сероспецифичность капсулы. J. Bacteriol. 191, 6203–6210. DOI: 10.1128 / JB.00592-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тиянонт, К., Доан, Т., Лазарус, М. Б., Фанг, X., Руднер, Д. З., и Уокер, С. (2006). Визуализация биосинтеза пептидогликана в Bacillus subtilis с флуоресцентными антибиотиками. Proc. Natl. Акад. Sci. США 103, 11033–11038. DOI: 10.1073 / pnas.0600829103

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Van den Abbeele, P., Taminiau, B., Pinheiro, I., Duysburgh, C., Jacobs, H., Pijls, L., et al. (2018). Арабиноксилоолигосахариды и инулин влияют на индивидуальные вариации на метаболизм и состав микробов, что иммуномодулирует клетки человека. J. Agric. Food Chem. 66, 1121–1130. DOI: 10.1021 / acs.jafc.7b04611

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ван дер Ваай, Л.А., Месандер, Г., Лимбург, П. К., и ван дер Ваай, Д. (1994). Прямопроточная цитометрия анаэробных бактерий в кале человека. Цитометрия 16, 270–279. DOI: 10.1002 / cyto.9

312

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

van Gelder, S., Rohrig, N., Schattenberg, F., Cichocki, N., Schumann, J., Schmalz, G., et al. (2018). Цитометрический подход для отслеживания изменений и динамики микробиоты слюны. Методы 134-135, 67–79. DOI: 10.1016 / j.ymeth.2017.08.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ван Хук, А. Х., Мевиус, Д., Герра, Б., Маллани, П., Робертс, А. П., и Аартс, Х. Дж. (2011). Приобретенные гены устойчивости к антибиотикам: обзор. Фронт. Microbiol. 2: 203. DOI: 10.3389 / fmicb.2011.00203

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Vandeputte, D., Kathagen, G., D’Hoe, K., Vieira-Silva, S., Valles-Colomer, M., Sabino, J., et al.(2017). Количественное профилирование микробиома связывает изменчивость кишечного сообщества с микробной нагрузкой. Природа 551, 507–511. DOI: 10.1038 / природа24460

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уокер, А. У., Дункан, С. Х., Мак-Вильям Лейтч, Э. К., Чайлд, М. У. и Флинт, Х. Дж. (2005). pH и поступление пептидов могут радикально изменить популяции бактерий и соотношение короткоцепочечных жирных кислот в микробных сообществах толстой кишки человека. Заявл. Environ. Microbiol. 71, 3692–3700. DOI: 10.1128 / AEM.71.7.3692-3700.2005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван В., Чжу Ю. и Чен Х. (2017). Селективная визуализация грамотрицательных и грамположительных микробиот в кишечнике мышей. Биохимия 56, 3889–3893. DOI: 10.1021 / acs.biochem.7b00539

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Визе, М., Хакимов, Б., Нильсен, С., Соренсен, Х., ван ден Берг, Ф., и Нильсен, Д.С. (2018). CoMiniGut — небольшая модель толстой кишки in vitro для скрининга процессов микробной ферментации кишечника. PeerJ 6: e4268. DOI: 10.7717 / peerj.4268

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уильямс, К. Ф., Уолтон, Г. Э., Цзян, Л., Пламмер, С., Гараиова, И., и Гибсон, Г. Р. (2015). Сравнительный анализ моделей кишечного тракта. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6, 329–350. DOI: 10.1146 / annurev-food-022814-015429

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ву, Г.D., Chen, J., Hoffmann, C., Bittinger, K., Chen, Y.Y., Keilbaugh, S.A., et al. (2011). Связывание долгосрочных диетических моделей с кишечными микробными энтеротипами. Наука 334, 105–108. DOI: 10.1126 / science.1208344

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zimmermann, J., Hübschmann, T., Schattenberg, F., Schumann, J., Durek, P., Riedel, R., et al. (2016). Проточная цитометрия микробиоты с высоким разрешением выявляет динамические изменения бактериального состава фекалий, связанные с колитом. Eur. J. Immunol. 46, 1300–1303. DOI: 10.1002 / eji.201646297

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

пятен — Ресурсный центр микробиологии

Подготовка мазка

Большинство бактерий не только очень маленькие, но и очень прозрачные, и их трудно рассмотреть под микроскопом без предварительного окрашивания. Вы должны прочно прикрепить свои бактерии к предметному стеклу, прежде чем сможете их окрасить. При подготовке предметного стекла к окрашиванию необходимо учитывать два важных момента:

1. Бактерии должны быть равномерно и слегка рассеяны.Если на слайде слишком много бактерий, они образуют большой шар, и вы не сможете увидеть морфологию отдельных клеток. Большие капли клеток также не окрашиваются должным образом и могут привести к ошибочным результатам из-за неправильного окрашивания.
2. Бактерии должны быть прочно прикреплены к предметному стеклу, чтобы они не смывались во время процедуры окрашивания. Все процедуры, которые прикрепляют бактерии к предметному стеклу, приводят к некоторым морфологическим изменениям. Клетки обычно уменьшаются в размерах и демонстрируют некоторые изменения формы и внеклеточного матрикса.

Вы будете готовить слайды для окрашивания как с поверхностей бульона, так и с агара. Хотя цели одинаковы для обоих: равномерно и слегка распределенные клетки, прочно прикрепленные к поверхности предметного стекла, методы немного различаются. Окрашивание — это такое же искусство, как и наука. Несомненно, вам потребуется несколько попыток, прежде чем вы добьетесь успеха.

Материалы

• Чистые предметные стекла
• Инокуляционные петли или иглы
• Стерильная вода
• Маркировочная ручка
• Ассорти бульонных и тарелочных культур

Меры безопасности

Будьте осторожны с аэрозолями при переносе бактерий с петли на предметное стекло.Петля очень гибкая, и с нее легко избавиться от петли, полной организмов. Не думайте, что ваш организм мертв. Фиксация тепла или метанола не гарантирует гибели организма. Выбросьте готовые слайды в ведро с дезинфицирующим средством на вашей скамейке.

Общие положения

Вы стремитесь получить легкую суспензию клеток, которая оставит на вашем слайде слабый мутный осадок. На слайде много места; используй это! Лучше сначала нарисовать круг в нижней части слайда, чтобы вы знали, где искать мазок.Очень легко запутаться, на какой стороне предметного стекла находится ваш мазок. Обязательно отметьте дальний край слайда. Делайте это последовательно на одном конце слайда, чтобы лучше сориентировать слайд.

Наберитесь терпения и дайте слайду высохнуть на воздухе, прежде чем прикреплять его к слайду. Если ваше слайд мокрое и вы закрепите его нагреванием, бактерии закипят и морфология клеток будет потеряна. Если ваше предметное стекло влажное и зафиксировать его в метаноле, оно, скорее всего, смывает предметное стекло.Слишком толстый мазок, скорее всего, смоет предметное стекло независимо от метода фиксации.

Мазок из бульона

Бульонные культуры обычно легче работать, потому что клетки уже разведены в бульоне. Обязательно тщательно перемешайте культуральную пробирку, чтобы бактерии оставались в бульоне.

1. Обозначьте слайд. С соблюдением правил асептики перенесите полную петлю организма в центр слайда.
2. Используйте плоскую часть петли, чтобы размазать каплю бульона по слайду.Используйте спиральные круговые движения, чтобы распределить каплю. Поскольку бульон полон белка, мазок обычно остается растянутым, а не шариками на поверхности предметного стекла.
3. Отложите слайд для сушки на воздухе. Это займет как минимум несколько минут. Не торопитесь с этим шагом.

Мазок с пластины

Петлей можно убрать множество организмов. Вы можете использовать иглу для посева, чтобы перенести свой организм на предметное стекло. Обязательно используйте стерильную воду для разбавления образцов.Обычная водопроводная вода или деионизированная вода в ваших бутылях для полоскания часто заражены бактериями.

1. Обозначьте слайд. С соблюдением правил асептики перенесите полную петлю стерильной воды в центр предметного стекла.
   • Это служит как для разведения бактерий, так и для распространения.
2. Выберите хорошо изолированную колонию.
3. Проколите его стерильной иглой или слегка зачерпните край колонии стерильной петлей.
4. Поместите иглу / петлю в центр капли и круговыми движениями по спирали распределите бактерии по слайду.
5. Отложите слайд для сушки на воздухе. Это займет как минимум несколько минут. Не торопитесь с этим шагом.

Крепление

Процедура фиксации одинакова независимо от источника мазка, чашки или бульона. Есть два метода прикрепления бактерий к предметному стеклу: фиксация тепла или фиксация метанолом. Термофиксация используется только для организмов BSL1. Организмы, с которыми мы будем работать, относятся к BSL2, поэтому вам нужно будет использовать метод фиксации метанолом. Тепловая фиксация предметного стекла может привести к образованию аэрозолей, а в случае организмов BSL2 нам необходимо максимально предотвратить это.Фиксация метанолом вызывает меньшие изменения клеточной морфологии и не создает аэрозолей.

Будьте осторожны при работе с метанолом, если вы забудете, что зафиксировали его метанолом, и ваше предметное стекло не полностью высохло, оставшийся метанол загорится.

Крепление метанола (BSL2)

1. Убедитесь, что слайд полностью высох. Установите его на стойку для окрашивания над раковиной.
2. Осторожно залейте предметное стекло 95% метанолом. Оставьте на две минуты.
3. Наклоните предметное стекло и слейте метанол.
   • Коснитесь краем предметного стекла бумажным полотенцем, чтобы удалить излишки метанола.
4. Отложите предметное стекло для просушки на воздухе перед окрашиванием.

Простое пятно

Простые пятна — это просто: добавьте одно пятно на фиксированное предметное стекло, дайте ему отстояться, смойте, дайте высохнуть и просмотрите. Это быстрая процедура определения присутствия и морфологии бактерий в клинических образцах, таких как стул и выделения.

Метиленовый синий используется для определения морфологии веретенообразных и спирохет при инфекциях полости рта.Это также предпочтительный краситель для идентификации метахроматических гранул в Corynebacterium diphtheriae . Гранулы будут окрашивать в более глубокий синий цвет, чем у окружающих синих бактерий. Остальные виды Corynebacterium не имеют метахроматических гранул. Подойдут любые базовые красители, такие как метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый или сафранин.

Основные (катионные или положительно заряженные) красители связываются с отрицательно заряженными компонентами клеточной мембраны и цитоплазмы.

Материалы

• Метиленовый синий
• Сафранин
• Кристально-фиолетовый
• Малахитовый зеленый
• Стойки для окрашивания
• Микро ящики для инструментов
• Готовые предметные стекла

Общие положения

Окрашивание — это отчасти искусство, а отчасти наука. Нет никаких жестких правил для времени окрашивания и полоскания. Указанное время — это рекомендации, которые обычно работают хорошо. Вам нужно будет поэкспериментировать с тем, что работает с вашими бактериями, и с методами, которые вы используете.

Очень важно записывать в своей лабораторной книжке именно то, что вы делаете, и наблюдаемые результаты. Вы будете повторять эти окрашивания позже в семестре и не хотите тратить свое время на повторное изобретение своей успешной процедуры окрашивания. Каждому участнику лабораторного стола будет полезно выбрать другое пятно, чтобы вы могли увидеть, как все они выглядят.

Простая процедура окрашивания

1. Поместите тщательно подготовленные фиксированные слайды для мазков на подставку для пятен над раковиной.
   • Делайте по одному слайду за раз.
   • Покройте мазок любым доступным вам основным красителем.
   • Достаточно краски, чтобы покрыть мазок. Пятно не должно стекать с предметного стекла.
2. Оставьте пятно на 1-5 минут.
3. Возьмитесь прищепкой за длинный конец предметного стекла, наклоните предметное стекло над раковиной и смойте пятно струей воды из бутылки для стирки.
   
   • Обязательно распылите средство над пятном и дайте ему стечь.
   • Если вы распыляете непосредственно на мазок, вы можете смыть его с предметного стекла.
   • Полоскать, пока вода не станет прозрачной или не станет слегка окрашенной.
4. Коснитесь краем предметного стекла бумажным полотенцем, чтобы удалить лишнюю воду. Теперь вы можете дать ему высохнуть на воздухе. Или вы можете высушить его промокательной бумагой, поместив ее в книгу для промокательной бумаги и слегка надавив. Хотя этот метод быстрее, вы также можете удалить плохо прилипший мазок.
5. Просмотрите слайд под масляной иммерсией и запишите свои наблюдения в лабораторную книгу.
6. Выбросьте использованные окрашенные предметные стекла в ведро с дезинфицирующим средством в раковине.

Отрицательное пятно

Отрицательные пятна даже проще, чем простые пятна, потому что вам не нужно делать мазок. Капля клеток распределяется на предметном стекле и просматривается без фиксации. Пятно представляет собой суспензию углерода, содержащегося в индийских чернилах или нигрозине. Углеродные частицы заряжены отрицательно, как и клеточная мембрана. Фон выглядит черным или окрашенным в цвет сепии, а клетки остаются прозрачными, поскольку они отталкивают краситель.

Некоторые положительно заряженные тельца включения, например сера, могут окрашивать. Это окрашивание дает точную информацию о морфологии клеток и наличии капсул, поскольку клетки не фиксируются. Размер клеток кажется немного больше, потому что любые внеклеточные покрытия или выделения на внешней стороне клеточной мембраны также не окрашиваются. Отрицательные окраски полезны для быстрого определения присутствия Cryptococcus neformans , возбудителя криптококциза, в спинномозговой жидкости.Этот метод также используется при окрашивании на эндоспоры и капсулы.

Материалы

• Краситель нигрозин
• Ассорти

Общие положения

Так же, как и при приготовлении мазка, нужно небольшое количество организма. Если у вас слишком много организмов, вы не сможете увидеть морфологию отдельных клеток. Также важно не употреблять слишком много нигрозина. Если он будет слишком толстым, фон будет выглядеть потрескавшимся, как лужи грязи, высыхающие на солнце.Вы хотите получить светлый фильм. Ваш инструктор продемонстрирует вам эту технику.

Процедура отрицательного окрашивания

1. Обозначьте слайд. Если вы работаете с бульонной культурой, поместите полную петлю организмов примерно на три четверти пути с левой стороны слайда. Если вы работаете с культурой на планшете, добавьте на предметное стекло каплю стерильной воды и разведите в ней свой организм, не растекая капли.
2. Нанесите одну или две капли нигрозина на другое предметное стекло.Используйте стерилизованную петлю, чтобы набрать петлю, полную нигрозина. Тщательно перемешайте его с каплей клеток, не растекая каплю слишком сильно.

3. Возьмите правый конец слайда в правую руку; левой рукой возьмите другой слайд под углом 45 ° или меньше к первому слайду, сразу после капли нигрозина / клеток.
4. Переместите наклонный слайд назад по поверхности первого слайда, пока он не коснется лишь капли нигрозина и клеток. Подождите, пока капиллярный эффект протянет жидкость вдоль передней кромки наклонного предметного стекла.
5. Протолкните наклонный суппорт по поверхности плоского суппорта. Большую часть нигрозина следует оставить на исходном месте. Выбросьте предметное стекло в ведро с дезинфицирующим средством.
6. Отложите окрашенное предметное стекло в сторону, чтобы оно высохло на воздухе, прежде чем наблюдать за ним в масляной ванне. Обязательно начинайте рассматривать свой слайд с участка с тусклым серым фоном.
7. Запишите свои наблюдения в лабораторную книгу.
8. Выбросьте использованные окрашенные предметные стекла в ведро с дезинфицирующим средством.

Особое примечание

Нигрозин очень легко снимается с предметного стекла и попадает на масляную иммерсионную линзу.Не забудьте тщательно очистить масляную линзу, когда закончите. Затем очистите его снова. После того, как он высохнет на линзе, его будет очень трудно удалить, и это ухудшит вашу способность (и других микро-студентов, использующих этот телескоп) четко видеть через линзу.

Пятно по грамму

Окраска по Граму — наиболее распространенная дифференциальная окраска, используемая в микробиологии. Для дифференциальных красок используется более одного красителя. Уникальные клеточные компоненты бактерий определяют, как они будут реагировать на различные красители.Процедура окрашивания по Граму практически не изменилась с момента ее разработки в 1884 году. Практически все бактерии можно разделить на две группы: грамотрицательные и грамположительные. Некоторые бактерии являются грамм-переменными. Trichomonas , Strongyloides , некоторые грибы и некоторые цисты простейших также имеют реакцию Грама. Очень маленькие бактерии или бактерии без клеточной стенки, такие как Treponema , Mycoplasma , Chlamydia или Rickettsia , не имеют реакции по Граму.Характеристика любых новых бактерий должна включать их грамм-реакцию.

Обычно дифференциальное пятно состоит из четырех компонентов; первичное пятно, протрава, закрепляющая пятно, обесцвечивающее средство для удаления основного пятна и контр-пятно. При окраске по Граму первичная окраска — кристально-фиолетовый. Это придает ячейке интенсивный фиолетовый цвет. Протравливание, йод, образует комплекс с кристаллическим фиолетовым внутри клеточной стенки. Затем ячейку промывают обесцвечивателем по Граму или 95% этанолом.Грамположительные клетки сохранят комплекс красителя и останутся пурпурными. Краситель вымывается из грамотрицательных клеток. Контркрашивание, сафранин, используется для окрашивания клеток, потерявших первичное пятно, иначе они останутся бесцветными, и вы не сможете их увидеть.

Большой комплекс йод-кристаллический фиолетовый сохраняется в клеточных стенках грамположительных клеток из-за молекулярной структуры многих слоев пептидогликана в клеточной стенке. Существует много сшитых тейхоевых кислот, и комплекс йод-краситель физически не может выйти.Кроме того, в мембране меньше липидов, и обесцвечивающий агент также не может добраться до нее. Грамотрицательные клетки имеют внешнюю мембрану и только один слой пептидогликана с большим количеством липидов. Краситель кристаллический фиолетовый легко вымывается.

Общие положения

Точность окрашивания по Граму зависит от целостности клеточной стенки бактерий. Есть множество вещей, которые могут повлиять на целостность клеточной стенки; старые клетки (т.е. культуры старше 24 часов), образец взят у кого-то, кто лечился антибиотиками, нацеленными на эту клеточную стенку, такими как пенициллин, с клетками грубо обращались или вы их фиксировали перегревом.В этих условиях грамположительные клетки будут считаться грамотрицательными. Если вы обесцвечиваете слишком долго, грамположительные клетки будут выглядеть как грамотрицательные. И наоборот, если вы недостаточно обесцвечиваете, грамположительные будут выглядеть грамположительными. Единственный способ, которым вы можете доверять своим результатам, — это всегда проводить известные грамположительные и известные грамотрицательные результаты на одном и том же слайде. Если они окрашивают так, как предполагалось, вы можете быть уверены, что результат вашего неизвестного образца надежен.

Чтобы добиться правильного окрашивания по Граму, нужна практика.Не ожидайте, что с первой попытки получите хорошее окрашивание по Граму. Лучше всего удерживать слайд прищепкой; Ваши перчатки станут довольно психоделическими, как и все, к чему вы прикасаетесь!

Процедура окрашивания по Граму

1. Обозначьте слайд. Подготовьте мазки на слайде с грамотрицательным слева, неизвестным в середине и грамположительным справа.
   
   • Не забудьте поправить слайд метанолом!
2. Положите слайд на штатив для окрашивания и покройте мазки кристально-фиолетовым на 1 минуту.
   
   • Используйте столько красителя, сколько нужно, чтобы полностью покрыть мазок, но не настолько, чтобы оно стекало или капало с предметного стекла.
3. Наклоните слайд, слейте кристаллический фиолетовый цвет и ненадолго промойте водой из промывочной бутылки.
   
   • Не распыляйте непосредственно на мазки, иначе вы их смоете.
4. Залейте предметное стекло йодной протравой на 1 минуту.
5. Наклоните предметное стекло, слейте излишки йода и аккуратно обесцвечивайте с помощью обесцвечивающего средства Грама, пока оно не станет прозрачным.
6. Наклоните слайд на бумажных полотенцах, чтобы удалить излишки красителя.
7. Залейте слайд сафранином на 1 минуту.
8. Наклоните предметное стекло, чтобы слить излишки сафранина, и осторожно промойте водой, пока он не станет прозрачным.
9. Дать слайду высохнуть на воздухе
10. Наблюдать при погружении в масло.
    • Грамположительный контроль должен быть фиолетовым, а грамотрицательный контроль — розовым.
11. Выбросьте использованное предметное стекло в ведро с дезинфицирующим средством.

Капсульный краситель (клебсиелла)

Краситель для красной капсулы Конго

Краситель Congo Red Capsule — это модификация отрицательного окрашивания на нигрозин, которое вы, возможно, делали ранее. Бактерии поглощают краситель конго красный, и фон окрашивается кислотным красителем фуксин. Слои капсулы или слизи из высокогидратированных полимеров исключают оба красителя. Фон станет синим, бактериальные клетки — розовыми, а прозрачные ореолы — это капсулы.

Клинически капсулы некоторых высокопатогенных бактерий (т.д .: пневмококки, Haemophilis influenzae и менингококки), можно различить с помощью антисыворотки, специфичной для этого типа капсул. Бактерии суспендируют в антисыворотке, а затем смешивают с метиленовым синим. В ходе процедуры окрашивания антисывороткой бактерии будут выглядеть синими, окруженными прозрачным ореолом, а затем окруженными тонкой синей линией там, где антисыворотка прикрепилась к капсуле.

Материалы

• Конго Красная морилка
• Кислотный фуксиновый краситель
• Кислый спирт
• Klebsiella pneumoniae культура
• Enterobacter aerogenes культура

Конго Процедура окрашивания красной капсулы

1. Поместите полную петлю Congo Red на слайд
2. Смешайте небольшое количество вашего организма с каплей Congo Red.
   
   • Хорошо распределите суспензию микроорганизмов / красителя на предметном стекле
3. Дайте слайду полностью высохнуть на воздухе.
4. Зафиксируйте засохшее предметное стекло кислотным спиртом на 15 секунд.
5. Промойте дистиллированной водой и покройте предметное стекло кислотным фуксином на 1-5 минут.
6. Промыть водой и дать высохнуть на воздухе.
7. Осмотрите предметное стекло, погруженное в масло.
   
   • Клетки окрашиваются в красный / розовый цвет, а капсулы выглядят как бесцветные ореолы на темно-синем фоне.

Эндоспорное пятно Виртца

Образование эндоспор характерно для видов Clostridum и Bacillus spp. Способность концентрироваться и покрывать свою протоплазму позволяет им выжить в неблагоприятных условиях окружающей среды, с которыми они сталкиваются в своей почвенной среде обитания. Это также позволяет спорам сопротивляться окрашиванию. «Живые» организмы легко визуализировать с помощью простых красителей и красителей по Граму.

Эндоспоры обычно обладают высокой преломляющей способностью, свет, падающий на них, отклоняется.Многие виды Bacillus имеют тела включения, которые обладают высокой рефрактильностью. Эти тельца включения могут выглядеть как эндоспоры при регулярном окрашивании. Присутствие эндоспор необходимо подтверждать с помощью красителей, специфичных для эндоспор. Наличие, характерная форма и положение эндоспор требуют специальных процедур для проникновения через слой эндоспор. Большинство пятен на эндоспоре связано с нагреванием предметных стекол, при этом они постоянно увлажняются красителем. Хотя он быстрее, он производит летучие химические вещества и представляет собой большой беспорядок.Те же результаты можно получить, оставив краситель на предметном стекле в течение 30 минут. Рекомендуется сначала запустить этот слайд и поработать над другим пятном, пока вы ждете, пока краситель проникнет в эндоспору.

Общие положения

Для окраски эндоспор вы будете использовать видов Bacillus . Форма и положение спор B. cereus очень похожи на споры B. anthracis . Bacillus не начинает образовывать споры, пока не закончится еда.Если культуры слишком молодые, вы в основном увидите только розовые палочки бактерий. Если культуры слишком старые, вы в основном увидите только маленькие зеленые овалы эндоспор. В идеале вы должны видеть зеленые овальные тела эндоспоры, окруженные розовой вегетативной бактериальной клеткой. Для получения наилучших результатов выберите образец из середины колонии с помощью прямой посевной иглы. Край колонии все еще активно растет, эндоспор будет мало.

Материалы

• Малахитовое зеленое пятно (5%)
• Сафранин (0.25%) — контрморилка
• Bacillus spp. плита

Процедура окрашивания эндоспор Wirtz

1. Сделайте мазок на Bacillus и зафиксируйте метанолом.
2. Залейте мазок малахитовым зеленым пятном.
3. Дайте пятну отстояться не менее 30 минут .
   
   • Добавьте еще пятна, если оно начнет сохнуть.
4. Промойте предметное стекло дистиллированной водой.
5. Залейте предметное стекло сафранином (0,25%) на 1-5 минут.
6. Промойте предметное стекло дистиллированной водой и дайте высохнуть на воздухе.
7. Наблюдать при погружении в масло.
   
   • Эндоспоры имеют голубой цвет, а бактериальные клетки розовые.

Модернизация методов окрашивания по Гольджи для получения трехмерного изображения отдельных нейронов с высоким разрешением

Животные

Все эксперименты на животных были одобрены Этическим комитетом KU Leuven (протокол P138 / 2017) и проводились в соответствии с правилами защиты животных Руководящие принципы комитета KU Leuven, Бельгия.Всего пятьдесят семь самцов и самок мышей C57BL / 6 в возрасте 4–6 недель для Golgi-Cox и исходной Golgi и две самки APP ^NL-GF , 25-месячных трансгенных мышей двух возрастных категорий. использовались соответствующие контрольные самки дикого типа. Животных умерщвляли смесью кетамина и ксилазина в соответствии с инструкциями учреждения.

Мышам транскардиально перфузировали 10 мл 0,9% хлорида натрия (# S7653, Sigma-Aldrich, Бельгия) в бидистиллированной воде (dH ₂ O) в течение 10 минут для Гольджи-Кокса, затем 10 мл в течение 10 минут. 4% PFA (# 15714, EMS, США) в 0.1 М фосфатный буфер (PB), pH 7,4. Для первоначального окрашивания по Гольджи стадия хлорида натрия была пропущена. Мозги были постфиксированы в течение ночи для исходного Гольджи или на 1 час для Гольджи-Кокса при 4 ° C. В некоторых экспериментах были изготовлены срезы коронального вибратома толщиной 100–500 мкм. Как правило, для визуализации с помощью световой микроскопии толщина срезов вибратома составляла от 100 до 500 мкм, для электронной микроскопии от 100 до 200 мкм и для Гольджи в сочетании с очисткой тканей 150-500 мкм.

Окрашивание по Гольджи-Коксу для LM

После трех промывок в 0.1 M PB, срезы или блоки ткани свободно плавали в растворе Гольджи-Кокса (см. Ниже) при комнатной температуре (RT) в течение 15–45 дней (см. Подробности в тексте) в темноте. Затем срезы или блоки промывали два раза в течение 5 минут с помощью dH ₂ O, переносили в 28% гидроксид аммония (# 221228, Sigma-Aldrich, Бельгия) в dH ₂ O и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с вращение. После двухкратной промывки в течение 5 минут с помощью dH ₂ O срезы инкубировали в 15% растворе Kodak Carestream Fixer (# P6557, Sigma-Aldrich, Бельгия) в dH ₂ O в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем два раза. Промывка в течение 5 минут с dH ₂ O.Блоки мозга после инкубации в 28% гидроксиде аммония в течение 60 мин и промывки dH ₂ O помещали в 3% агарозу в dH ₂ O и делали срезы вибратома толщиной 150–300 мкм. Срезы инкубировали в 15% растворе Kodak Carestream Fixer в dH ₂ O в течение 10 минут при комнатной температуре с последующим нанесением на покрытые желатином предметные стекла для микроскопии, сушили при комнатной температуре и покрывали покровными стеклами в монтажной среде Mowiol (# 81381- 50 G, Sigma-Aldrich). Целые срезы визуализировали с помощью стереомикроскопа Zeiss, а клетки / шипы визуализировали с помощью широкоугольного микроскопа Zeiss Axioplan 2 с использованием объектива с 20-кратным и 40-кратным увеличением.

Раствор Гольджи-Кокса представляет собой смесь трех компонентов: (A) 5% дихромат калия в dH ₂ O (# P5271, Sigma-Aldrich, Бельгия), (B) 5% хлорид ртути (# KK04.1, Carl Roth GmbH, Германия) в dH ₂ O, растворенном при нагревании до 60 ° C, и (C) 5% хромат калия в dH ₂ O (# HN33.1, Carl Roth GmbH, Германия). Сначала 50 мл раствора RT A смешивают с 50 мл раствора RT B. Затем 40 мл раствора RT C смешивают со 100 мл dH ₂ O и медленно добавляют к смеси при перемешивании.После перемешивания в течение дополнительных 2–5 мин раствор накрывают алюминиевой фольгой и оставляют при комнатной температуре на ночь, после чего образуется красно-желтый осадок. Раствор осторожно аспирируют, оставляя осадок и поверхностный слой нетронутыми, пропускают через фильтр 0,2 мкм и используют в течение 20–30 дней после приготовления.

Оригинальное окрашивание по Гольджи для LM и EM

Срезы вибратома размером 100–200 мкм или блоки головного мозга промывали трижды 0,1 М PB и инкубировали в течение десяти дней из трех.5% дихромат калия в dH ₂ O при комнатной температуре в темноте, свободно плавающий. Затем 5–6 срезов собирали мягкой кистью для рисования (серия 150, размер 1; Talens, Нидерланды) на предметные стекла микроскопа и закрывали покровными стеклами размером 22 × 22 мм, углы которых были погружены в коммерческий цианоакрилатный клей. «Сэндвич» и фрагменты мозга помещали в сосуды Коплина объемом 250 мл, полностью заполненные 1% нитратом серебра (# RT210560, EMS, USA) в dH ₂ О. Через три дня при 37 ° C в темноте окрашивание проверяли с помощью широкопольного светового микроскопа и, если окрашивание оказывалось недостаточным, инкубацию в 1% нитрате серебра продлевали.

Следующие шаги относятся к разделам. После отсоединения срезов от предметных стекол и промывки их в 0,1 M PB, осадки были удалены, осторожно соскребая поверхность срезов малярной кистью в 0,1 M PB (дополнительное видео 1). Срезы можно хранить в 0,1 M PB при 4 ° C до получения изображений с помощью широкоугольного светового микроскопа для выбора окрашенных нейронов. Все срезы были получены с помощью микроскопа Zeiss Elyra S.1 с 4-кратным объективом (рис. 6а и 7а). Затем секции были обрезаны до размера прибл.1 мм² вокруг интересующего нейрона, желательно таким образом, чтобы можно было легко ориентировать обрезанный образец (рис. 6a – c и рис. 7a – c), а интересующие области были визуализированы с помощью микроскопа Zeiss Elyra S.1 с использованием микроскопа Zeiss Elyra S.1. 4-кратный объектив.

Обрезанные срезы трижды промывали в dH ₂ O в течение 10 минут с последующей инкубацией в 0,05% хлориде золота (# RT16586, EMS, USA) в dH ₂ O при 4 ° C в темноте при перемешивании. на 40 мин (для лучшей сохранности ультраструктурных деталей) или на 60 мин (для более легкого отслеживания), и от 30 до 60 мин для этапа очистки.Образцы снова трижды промывали в течение 10 минут ледяной водой dH ₂ O, инкубировали 10 минут в ледяной 0,5% щавелевой кислоте (# 241172, Sigma-Aldrich, Бельгия), трижды промывали ледяной водой. ₂ O в течение 10 мин и инкубировали в 1% тиосульфате натрия (# RT21360, EMS, USA) при 4 ° C с вращением в течение ночи. Срезы (z-стек) получали с помощью микроскопа Zeiss Elyra S.1 с дифференциальным интерференционным контрастом (ДИК) с использованием объективов 4x и 40x.

Затем образцы окрашивали 1% тетроксидом осмия (# 19152, EMS, США) и 1.5% ферроцианид калия (# 455989, Sigma-Aldrich, Бельгия) в течение 1 часа, затем 0,2% дубильная кислота (# 21700, EMS, США) и снова 1% тетроксид осмия при комнатной температуре в течение 30 минут с промывкой в ​​dH _{. 2} O между ступенями. Затем образцы инкубировали в 0,5% уранилацетате (# 22400, EMS, США) в 25% метаноле в течение ночи при 4 ° C и окрашивали en bloc аспартатом свинца Уолтона ³² в течение 30 минут при 60 ° C. После промывки dH ₂ O образцы дегидратировали в восходящей серии этанола (30%, 50%, 70%, 80%, 95%, 100%), 10 мин на шаг при 4 ° C.Образцы дважды обрабатывали пропиленоксидом по 10 мин при комнатной температуре и пропитывали твердыми смесями Epon 812 / пропиленоксид. На следующий день срезы помещали в твердую композицию Epon 812 (№ 14120, EMS, США) между двумя предметными стеклами микроскопа и пленкой ACLAR (№ 50425, EMS, США) и полимеризовали в течение 2 дней при 60 ° C.

Для отслеживания импрегнированных нейронов в объеме образцы, окрашенные в золото в течение 60 минут, получали с помощью сканирующего электронного микроскопа Zeiss Sigma Variable Pressure (Zeiss, Германия), оборудованного встроенным ультрамикротомом (Gatan, 3View, Франция).Плоские заделанные секции монтировались на алюминиевые штыревые наконечники (Gatan, Франция) с электропроводной эпоксидной смолой (Circuit Works, # 16043, Ted Pella, Германия). Интересующие нейроны могут быть локализованы на основе окрашивания и визуализации LM, а также геометрии соседних кровеносных сосудов. После приближения к интересующему пропитанному нейрону производили серийное срезы с шагом 200 нм. Это приращение было выбрано для облегчения визуализации всего объема нейронов, необходимого для отслеживания, с разумной скоростью. Кроме того, разделение больших образцов с шагом z ниже определенного порога приводит к артефактам изображения, возникающим из-за накопления локального отрицательного заряда, когда глубина проникновения электронного зонда превышает толщину сечения.Связанные с этим и, возможно, из-за резистивного нагрева смолы или других изменений смолы, могут возникать артефакты секционирования, такие как неполное секционирование или пропуск секций. Мы не наблюдали каких-либо явных различий в дендритной морфологии импрегнированных нейронов при использовании 200 нм против 100 нм (стандартная толщина для ПЭМ) в пилотных исследованиях (данные не показаны). При необходимости можно использовать меньшие z-шаги, но может потребоваться дополнительная оптимизация.

Последовательные электронные микроскопические изображения половины объема импрегнированного нейрона были получены в 1.3 кВ с полем зрения 200 × 200 мкм при времени выдержки 2 мкс, 0,012 мкм / пиксель (время визуализации составляло 6 минут на секцию). Затем, чтобы восстановить синапсы, связанные с импрегнированным нейроном (дополнительное видео 4), блок удаляли из микроскопа, как только интересующая область была идентифицирована для ручного сечения импрегнированного нейрона толщиной 2–5 мкм и после ручного разрезания возвращалась в BF-SEM. для отображаемого остального объема с такими же параметрами. Изображения BF-SEM были совмещены с использованием программного обеспечения Digital Micrograph (Gatan).Мы разработали полуавтоматический алгоритм сегментации нейронов, отображаемых в стеке (см. Ниже и дополнительное видео 3). Реконструкция сегментированных нейронов выполнялась с использованием программного обеспечения Amira (FEI / Thermo Fisher Scientific, Франция), сегментация и реконструкция синапсов импрегнированного нейрона также выполнялась с помощью программного обеспечения Amira.

Для наблюдения ультраструктурных деталей импрегнированных нейронов с высоким разрешением блоки, содержащие образцы, окрашенные золотом в течение 40 минут, удаляли из микроскопа после того, как интересующая область была идентифицирована с помощью BF-SEM (рис.6). Серийные ультратонкие срезы получали вручную с использованием ультрамикротома Reichert Ultracut E. Все срезы собирали в виде лент из 4–5 сечений на сетке с тремя пазами (Ted Pella, Германия). Изображения получали на микроскопе ТЕМ (JEM1400-LaB6, JEOL, Япония), работающем при 80 кВ. ПЭМ был оснащен камерой Olympus SIS Quemesa 11 МП. Фотографии были сделаны при разном увеличении (0,6–20кх).

Очистка по Гольджи для LM с использованием метода CUBIC

После окрашивания по Гольджи-Коксу и Гольджи образцы (срезы или блоки головного мозга) были очищены с использованием протокола CUBIC.Для образцов, окрашенных по Гольджи-Коксу, очищение тканей начинали после инкубации с 15% фиксатором Kodak, а для исходных образцов, окрашенных по Гольджи, после 0,05% хлорида золота в течение 30–60 мин. Образцы промывали трижды в dH ₂ O в течение 10 мин с последующей инкубацией в растворе CUBIC: 250 г / л мочевины (№ 821527, ICN Biomedicals, США), 250 г / л Quadrol (№ 122262, Sigma-Aldrich. , Бельгия) и 150 г / л Triton X-100 (# RT22140, EMS, USA), последовательно растворенных в dH ₂ O при нагревании и перемешивании и охлажденных до комнатной температуры).Образцы, окрашенные по Гольджи-Коксу, инкубировали в течение 10 мин — 8 дней (см. Текст) в смеси равных частей раствора CUBIC и dH ₂ O при 37 ° C в темноте при перемешивании. Исходные образцы, окрашенные по Гольджи, были отправлены по тому же протоколу CUBIC, и инкубация продолжалась до достижения желаемого уровня очистки тканей, 1-21 день (см. Текст).

Образцы были визуализированы непосредственно в очищающих растворах. Трехмерные световые микроскопические изображения были получены с помощью устройства Bioptonics OPT (рис. 3k, l и дополнительное видео 2) или вращающегося диска Nikon, конфокального с помощью объектива CFI Plan Apo 10XC Glyc для очистки приложений (рис.3д, е). Все образцы были получены с помощью стереомикроскопа Zeiss (рис. 3a – d, g – j).

Гольджи-Кокса и флуоресцентное окрашивание для LM

Срезы пропитывали протоколом Гольджи-Кокса, как указано выше. После стадии гидроксида аммония и двухкратной промывки в течение 5 минут dH ₂ O срезы окрашивали 0,05% тиофлавином-S (# T1892-25G, Sigma-Aldrich, Бельгия) в 50% метаноле в течение 20 минут при осторожном воздействии. волнение в темноте. Образцы дважды промывали dH ₂ O в течение 5 минут, инкубировали в фиксаторе Kodak в течение 10 минут и дважды промывали перед очисткой по протоколу CUBIC в течение 10 минут.Срезы были закреплены в последней смене раствора CUBIC и визуализированы с помощью широкопольной флуоресценции Zeiss Axioplan 2 с объективом 5x и 40x (рис. 5a – c).

Плагин ImageJ для сегментации ЭМ-изображений, окрашенных Гольджи

Инструмент GolgiStain — это плагин для ImageJ2 (http://imagej.net/) или Fiji2 (https://fiji.sc/), который можно загрузить по адресу http://bioimagingcore.be/plugin/golgi-stain-1.2.0.jar. Он работает на всех системах, поддерживаемых ImageJ2. Чтобы установить последнюю версию GolgiStain, добавьте сайт GolgiStain в свой список сайтов обновлений ImageJ следующим образом: (1) в меню ImageJ выберите Help ▶ Update …, (2) затем нажмите Manage update sites , ( 3) нажимаем Добавить сайт обновления , заполняем http: // sites.imagej.net/GolgiStain/ в качестве URL-адреса, укажите имя (например, GolgiStain), убедитесь, что флажок установлен, нажмите Закрыть и, наконец, (4) нажмите Применить изменения и перезапустите ImageJ. Альтернативный метод установки — перетащить файл golgi-Stain-1.2.0-.jar в каталог плагина ImageJ; в этом случае обновления плагина также необходимо будет выполнить вручную.

Инструкции по быстрому запуску

(1) Загрузите набор данных в ImageJ. Набор данных должен быть 8- или 16-битным изображением в градациях серого или стеком изображений.(2) Запустите плагин GolgiStain из меню: Плагины ▶ GolgiStain. Появится окно плагина с полями для ввода параметров сегментации. (3) Настройте параметры сегментации (см. Дополнительное видео 3). Если установлен флажок Предварительный просмотр, появится красный оверлей, показывающий результат сегментации. Для стеков изображений срез, который будет использоваться для предварительного просмотра сегментации, можно указать с помощью поля ввода Slice # для Preview . (4) Нажмите OK, чтобы выполнить сегментацию изображения или всей стопки изображений.Если установлен флажок Mask Segmentation Only , каждый фрагмент на выходе будет двоичной маской; в противном случае создается многоканальный выходной сигнал, в котором канал 1 является исходными данными, а канал 2 является маской.

Плагин выполняет сегментацию изображений с помощью конвейера простых операций. Поскольку частицы пятна Гольджи очень плотные, их можно легко идентифицировать на изображении с помощью простого определения порога. Соседние частицы затем объединяются в смежные области с помощью комбинации морфологического закрытия и размытия по Гауссу (морфологическое закрытие эффективно соединяет соседние частицы и закрывает дыры, но приводит к резким неровным контурам области, последующее размытие по Гауссу с последующей пороговой обработкой сглаживает контуры области.). Полученное изображение затем снова подвергается пороговой обработке для извлечения двоичных масок для окрашенных областей. Наконец, небольшие изолированные окрашивающие частицы можно удалить путем фильтрации областей по площади.

Описание параметров сегментации

• Макс. Интенсивность окрашивания частиц : пороговое значение, которое будет использоваться для определения того, какие пиксели считаются гранулами пятна Гольджи. Только пиксели с интенсивностью от 0 до введенного значения считаются окрашивающими частицами; все остальные пиксели «отбрасываются».

• Радиус закрытия (в пикселях) : Степень морфологического закрытия. Все частицы, находящиеся на таком расстоянии друг от друга, будут объединены.

• Расстояние размытия (в пикселях) : Размер размытия по Гауссу. Его эффект заключается в сглаживании контуров областей сегментации.

• Мин. Интенсивность сегмента : Пороговое значение интенсивности пикселя, используемое для извлечения фактических областей сегментации после размытия по Гауссу.Маленькие значения приведут к сегментации, когда границы области будут слишком далеко от окрашивающих частиц, тогда как слишком большие значения приведут к отсоединенным областям. Сначала установите это значение на 1, оптимизируя другие параметры. Как только будет получена разумная сегментация, это значение можно постепенно увеличивать, чтобы приблизить границы области к окрашивающим частицам.

• Мин. Размер сегмента (в пикселях) : это минимальная область (в количестве пикселей) для области, которая должна быть разрешена в окончательном выводе сегментации.Он используется для удаления крошечных изолированных, окрашенных участков. Лучше всего изначально установить значение 0, чтобы избежать случайного подавления соответствующих областей сегментации. После того, как все другие параметры оптимизированы, это значение может (необязательно) быть увеличено для удаления, например, областей, которые предположительно являются неспецифическими.

• Только маска сегментации : Если этот флажок установлен, на выходе будет маска двоичной сегментации.Если этот флажок не установлен, на выходе будет двухканальное изображение (стек), где канал 1 — исходные данные, а канал 2 — маска сегментации. Двухканальный вывод очень удобен для проверки результата сегментации, но требует больше памяти компьютера. Двоичный вывод также может быть предпочтительным для дальнейшей обработки, такой как 3D-реконструкции.

• Непрозрачность предварительного просмотра (в%) : процент непрозрачности, установленный для наложения предварительного просмотра, чем выше, тем более непрозрачным.

• Номер фрагмента для предварительного просмотра : Номер фрагмента, для которого необходимо просмотреть результат сегментации. Он используется для стопки изображений (> 1 изображение).

• Preview : Если этот флажок установлен, оверлей предварительного просмотра будет пересчитываться и перерисовываться каждый раз, когда пользователь изменяет параметр сегментации и нажимает Enter .

Подробности алгоритма

Конвейер сегментации состоит из следующей последовательности шагов обработки изображения (рис. 8).

1. (1)

   Выполняется начальный порог. Для всех пикселей между 0 и пороговым значением T ₁ , введенным пользователем, устанавливается максимальная интенсивность пикселей 2 ^b — 1, для остальных — 0.{b} -1 \, {\ rm {иначе}} \ end {array} $$

2. (2)

   Операция морфологического закрытия применяется к двоичному изображению, полученному на шаге 1, для соединения разрозненных окрашенных частиц:

   $$ A \ cdot B = (A \ oplus B) -B $$

   A — двоичное входное изображение, B — круговой структурирующий элемент с заданным пользователем радиусом, а \ (A \ cdot B \) — результат фильтрации.{2}}} $$

3. (4)

   Затем используется второй порог, чтобы выбрать из размытого изображения те пиксели, которые считаются положительным окрашиванием. Все пиксели выше порогового значения T ₂ устанавливаются на максимальную интенсивность пикселя 2 ^b — 1. {b} — 1 \, {\ rm {иначе}} \ end {array} $$

4. (5)

   Пороговое изображение обрабатывается как двоичное изображение областей сегментации.Области фильтруются по размеру с помощью стандартного инструмента Particle Analysis от ImageJ. Области с площадью меньше заданного пользователем минимума (обведены красным на рис. 8) отбрасываются.

5. (6)

   Наконец, результирующие области сегментации отображаются либо как маска двоичной сегментации, либо как прозрачное наложение поверх исходного изображения.

Рисунок 8

Конвейер сегментации для ImageJ. Плотные частицы, окрашенные Гольджи, обнаруживаются на изображении с помощью простой операции определения порога (1). Затем полученные дискретные объекты объединяются в смежные области с помощью операции морфологического закрытия (2). Чтобы сгладить эти области, применяется фильтр размытия по Гауссу (3), за которым следует вторая операция определения порога (4). Неспецифическое окрашивание удаляется путем сортировки сегментированных областей по площади и отбрасывания областей с площадью ниже заданного пользователем порога (5).Остальные области представляют собой результат сегментации и добавляются в качестве прозрачного канала к исходному стеку изображений (6). В качестве альтернативы они могут быть возвращены как стек масок двоичной сегментации.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.